發(fā)布時間：2019-03-07 16:38

【摘要】： 背景與目的： 黑色素瘤抗原(Melanoma antigen，MAGE)是從黑色素瘤中發(fā)現的一組腫瘤相關性抗原(tumor-associated antigen，TAA)。MAGE是一類超家族抗原，主要包括四個亞家族：MAGE-A，，MAGE-B，MAGE-C和MAGE-D，其中MAGE-A又包含MAGE-1至MAGE-12共12個基因。近年來，大量國內外文獻均報道MAGE-1基因在肝癌、食管癌、胃癌、舌癌、白血病、頭頸癌、肺癌、神經母細胞瘤等常見腫瘤中都有較高的表達率，在正常組織中MAGE-1只表達于睪丸和胎盤，而睪丸和胎盤是免疫豁免組織，不會受到免疫活性細胞的攻擊。因此，MAGE-1在腫瘤中表達的廣泛性和相對特異性使其具有很好的應用前景并以此成為研究的熱點。迄今為止，已發(fā)現8個由MAGE-1基因編碼的HLA-Ⅰ類分子限制的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)表位，MAGE-1可以激活免疫系統(tǒng)中的前體T細胞形成特異性的CTL，CTL通過識別腫瘤表達的MAGE-1抗原特異性的殺傷腫瘤細胞，這一結果為MAGE-1的應用提供了有力的實驗依據。研究表明，在腫瘤抗原的特異性識別過程中，B7作為T細胞活化的共刺激信號，具有促進T細胞增值，抑制T細胞凋亡，增強T細胞對抗原的敏感性，介導T、B細胞的黏附，促進體液免疫應答。大多數腫瘤細胞表面不表達B7分子(B7-1或B7.2)或表達水平很低，致使第二信號通路受阻，無法誘導特異性CTL的產生，將B7.2分子的cDNA導入腫瘤細胞則能誘導抗腫瘤免疫應答。目前，有關B7.2在腫瘤免疫治療中的應用研究已有很多，Vasilevko等構建MUC1粘蛋白(簡稱MUC1)和B7.2的共表達載體，以基因槍的方式免疫小鼠然后接種表達MUC1的乳腺癌細胞系，可以延長成瘤時間，抑制腫瘤生長。Disis的研究結果表明，編碼neu(編碼具有酪氨酸激酶活性的糖蛋白)的和B7.2的質粒經皮下注射，可以誘發(fā)neu特異性的細胞和體液免疫反應，發(fā)揮抗腫瘤作用。但將B7.2與MAGE-1基因融合構建真核共表達質粒，使得MAGE-1和B7.2能夠在同一細胞中同時表達，執(zhí)行協同抗腫瘤免疫效應，還未見報道。本課題選用MAGE-1及B7.2基因片段，以pEGFP-C3質粒為載體，構建pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1真核共表達載體，并通過脂質體介導轉染人食管癌細胞株EC9706，觀察其表達，以獲得綠色熒光真核共表達載體pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1，旨在為進一步探討以MAGE-1為靶點的腫瘤主動免疫治療提供實驗基礎。 方法： 1．真核共表達載體pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1的構建：參照GenBank收入的B7.2及MAGE-1基因序列，應用Oligo 6.0基因分析軟件分析設計PCR引物，并在每條引物前分別加上限制性酶切位點。用RNA提取試劑盒分別從乳腺組織、乳腺癌組織中提取總RNA。用RT-PCR方法，擴增目的基因B7.2和MAGE-1片段。然后用膠回收試劑盒純化PCR產物B7.2基因片段和MAGE-1基因片段，并分別與載體pGEM-T Easy連接。將構建的pGEM-T-B7.2用質粒純化試劑盒提取，再用XhoⅠ、SalⅠ內切酶將B7.2從質粒上切取、膠回收純化后，與用XhoⅠ、SalⅠ酶切過的pEGFP-C3真核表達質粒連接。分別將構建的pGEM-T-MAGE-1、pEGFP-C3-B7.2質粒用KpnⅠ、SalⅠ內切酶消化，膠回收雙粘MAGE-1和雙粘pEGFP-C3-B7.2，用T4DNA連接酶連接，構建的pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1真核共表達載體經PCR、酶切和測序鑒定。 2．人B7.2/MAGE-1轉染食管癌EC9706細胞：應用脂質體轉染技術，將重組質粒pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1轉染EC9706細胞，24h后在熒光倒置顯微鏡下觀察融合基因的表達情況。G418加壓篩選20d，獲得穩(wěn)定表達融合基因的EC9706細胞，用RT-PCR在mRNA水平檢測B7.2/MAGE-1基因的表達。 結果： 1．通過RT-PCR擴增獲得B7.2目的基因片段(119-719)，加上兩端內切酶位點為618個堿基對；通過RT-PCR擴增獲得MAGE-1目的基因片段(626-1159)，加上兩端內切酶位點約545個堿基對。 2．成功構建了pGEM-T-B7.2及pGEM-T-MAGE-1原核重組載體，B7.2及MAGE-1基因的測序結果與GenBank公布的一致。 3．成功構建了pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1真核共表達載體，經PCR和XhoⅠ、KpnⅠ雙酶切鑒定其目的片段大小與預期的一致。 4．建立了穩(wěn)定表達B7.2/MAGE-1的EC9706細胞系，經熒光顯微鏡觀察，轉染24h后細胞內發(fā)出綠色熒光；用RT-PCR在mRNA水平檢測B7.2/MAGE-1基因的表達，其大小與預期的一致。 結論 1．本研究成功構建了MAGE-1與B7.2真核共表達載體。 2．本研究獲得了能穩(wěn)定表達MAGE-1和B7.2的EC9706細胞。 3．本研究為進一步探討以MAGE-1為靶點的腫瘤主動免疫治療提供了重要的實驗基礎
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【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R346

【參考文獻】

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本文編號：2436272