【摘要】：目的 對(duì)淮南地區(qū)粉塵螨Ⅰ、Ⅱ類變應(yīng)原cDNA進(jìn)行克隆、表達(dá)。 方法 采集淮南地區(qū)粉塵螨進(jìn)行人工飼養(yǎng),用Trizol提取總RNA,以O(shè)ligodT-Adaptor Primer為反轉(zhuǎn)錄引物,使用TaKaRa RNA LA PCR TMKit(AMV)Ver.1.1合成cDNA。根據(jù)GenBank粉塵螨Der f1、Der f2 cDNA基因序列(登錄號(hào)分別為:emb | X65196.1, D10448),分別設(shè)計(jì)、合成一對(duì)特異性引物,采用RT-PCR、PCR法擴(kuò)增出目的基因片段,按照常規(guī)的基因操作技術(shù)進(jìn)行Der f1 cDNA、Der f2 cDNA的克隆、亞克隆、表達(dá)及鑒定。挑選出陽(yáng)性克隆菌(含pMD-18T-Der f1、pMD-18T-Der f2)進(jìn)行序列測(cè)定,并亞克隆至表達(dá)質(zhì)粒,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-Der f1、pET32a(+)-Der f2,誘導(dǎo)Der f1、Der f2基因的表達(dá),進(jìn)行Der f1、Der f2蛋白的SDS-PAGE分析,并對(duì)SDS-PAGE蛋白條帶進(jìn)行凝膠掃描定量分析。 結(jié)果 ①行RT-PCR、PCR,自粉塵螨基因組中特異擴(kuò)增出大小約646bp、455bp基因片段。②pMD-18T-Der f1和pMD-18T-Der f2重組質(zhì)粒中插入片段的測(cè)序結(jié)果與GenBank登錄的相應(yīng)序列比較,發(fā)現(xiàn)Der f1核苷酸同源性為99.52%,其讀碼框自9至638;Der f2與郝敏麒等報(bào)道的廣州地區(qū)粉塵螨Der f2的cDNA序列(AF346905)相比,未發(fā)現(xiàn)有插入序列。③表達(dá)載體pET32a(+)-Der f1、pET32a(+)-Der f2經(jīng)酶切及PCR擴(kuò)增后,在預(yù)期位置上可見(jiàn)DNA條帶,證實(shí)表達(dá)載體構(gòu)建成功。④含pET32a(+)-Der f1、pET32a(+)-Der f2工程菌經(jīng)超聲破碎集菌后,分別取其上清及沉淀行SDS-PAGE分析,發(fā)現(xiàn)沉淀中有目的蛋白的表達(dá),其分子量分別約為45kDa、34kDa。 結(jié)論 ①成功進(jìn)行粉塵螨Der f1、Der f2 cDNA體外擴(kuò)增,序列分析結(jié)果證實(shí),淮南地區(qū)Der f1 cDNA與國(guó)外粉塵螨Der f1 cDNA序列存在一定差異,Der f2 cDNA與國(guó)內(nèi)粉塵螨Der f2 cDNA存在一定差異,主要表現(xiàn)為缺失一約87bp的插入序列。②成功地構(gòu)建了Der f1、Der f2 cDNA的重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-Der f1、pET32a(+)-Der f2,在大腸桿菌中高效表達(dá),獲得大量rDer f1和rDer f2,為螨性變態(tài)反應(yīng)性疾病特異性免疫診斷和治療試劑盒的研制奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective to clone and express class 鈪，

本文編號(hào)：2418204