【摘要】： 疼痛是臨床上常見的癥狀,常給病人帶來極大的痛苦。有關(guān)痛覺過敏的發(fā)生機(jī)制,目前普遍認(rèn)為主要是由于外周傷害性信息持續(xù)傳入,導(dǎo)致初級神經(jīng)末梢釋放大量的神經(jīng)遞質(zhì),這些遞質(zhì)作用于脊髓后角次級神經(jīng)元上相應(yīng)受體,激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,引起一氧化氮(nitric oxide, NO)產(chǎn)生增加以及蛋白激酶C(protein kinase, PKC)激活,二者可通過復(fù)雜的機(jī)制引起痛感受和痛覺過敏。 我室曾靜波[1,2]的研究發(fā)現(xiàn),大鼠右后掌注射甲醛后能引起脊髓后角神經(jīng)元一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)活性升高及NO產(chǎn)生增多。我室胡玉燕[3]近期的研究結(jié)果顯示,甲醛炎性痛可以誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡,側(cè)腦室注射NMDA受體拮抗劑MK-801可抑制甲醛炎性痛誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及凋亡相關(guān)基因的表達(dá),提示,中樞內(nèi)興奮性氨基酸(excitatory amino acids, EAAs)釋放及其受體的激活參與了傷害性信息傳入對大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的誘導(dǎo)。 傷害性信息傳入到脊髓引起的大量遞質(zhì)釋放及其受體的過度激活是否也會引起脊髓神經(jīng)元凋亡,在此過程N(yùn)O生成增多是否在神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮作用,目前尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。 因此,本實(shí)驗(yàn)觀察了大鼠甲醛炎性痛時(shí)脊髓后角神經(jīng)元凋亡的改變,并觀察了這一改變的時(shí)間特征。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步觀察了一氧化氮在甲醛炎性痛誘導(dǎo)大鼠脊髓后角神經(jīng)元凋亡中的作用。 1甲醛炎性痛致大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡 方法健康雄性Sprague-Dawley大鼠30只,體重280±20克,隨機(jī)分為6組,分別為:對照組(control組),甲醛1d組(F 1d組),甲醛2d組(F 2d組),甲醛3 d組(F 3d組),甲醛4d組(F 4d組),甲醛7d組(F 7d組),每組5只動(dòng)物。對照組不加任何處理,直接斷頭取材。足底注射甲醛1d、2d、3d、4d、7d組分別于大鼠右側(cè)足底注射0.2 ml 5%甲醛溶液致外周炎性痛后,立即計(jì)數(shù)1h內(nèi)每5 min大鼠自發(fā)縮足次數(shù),于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)斷頭取材,采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測L4～5脊髓節(jié)段神經(jīng)元的凋亡率。 結(jié)果結(jié)果發(fā)現(xiàn),足底注射甲醛可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生一個(gè)雙相的自發(fā)痛反應(yīng),表現(xiàn)為嘶叫、自發(fā)性縮足,舔咬患爪等。大鼠第一時(shí)相痛反應(yīng)在足底注射甲醛后立即出現(xiàn),持續(xù)5~10 min;經(jīng)過短暫間歇期(約5 min)出現(xiàn)第二時(shí)相疼痛反應(yīng),可持續(xù)40 min以上。 正常對照組大鼠L4～5脊髓節(jié)段神經(jīng)元的凋亡率很低,與對照組相比,足底注射甲醛后1d時(shí),神經(jīng)元凋亡率即明顯增加(P0.05),3d時(shí)神經(jīng)元凋亡率達(dá)高峰,注射甲醛后4d,大鼠L4～5脊髓節(jié)段神經(jīng)元凋亡率有所降低,但仍高于對照組水平(P0.05),7d時(shí)神經(jīng)元凋亡率基本恢復(fù)至正常水平。 結(jié)論結(jié)果表明,甲醛炎性痛可誘導(dǎo)大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡的發(fā)生,注射甲醛后3d凋亡達(dá)高峰,7d時(shí)基本恢復(fù)至正常水平。 2 NO在甲醛炎性痛誘導(dǎo)大鼠脊髓后角神經(jīng)元凋亡中的作用 方法健康雄性Sprague-Dawley大鼠70只,體重280±20克,隨機(jī)分為7組,分別為正常對照組,鞘內(nèi)注射L-精氨酸組(L-Arg組),甲醛組(F組),甲醛+鞘內(nèi)注射生理鹽水組(F+NS組),甲醛+鞘內(nèi)注射L-NAME 0.5μmol組(F+L-NAME 0.5μmol組)、甲醛+鞘內(nèi)注射L-NAME 2μmol組(F+L-NAME 2μmol組)及甲醛+鞘內(nèi)注射L-NAME 4μmol組(F+L-NAME 4μmol組)。各組均為10只動(dòng)物,其中5只用于脊髓神經(jīng)元凋亡率變化的觀察,5只用于觀察脊髓后角神經(jīng)元p53蛋白的表達(dá)。正常對照組不加任何處理,直接斷頭取材; L-Arg組動(dòng)物鞘內(nèi)注射10μl L-Arg溶液(含4.7μmol L-Arg)后首先計(jì)數(shù)1h內(nèi)縮足次數(shù),12h時(shí)直接斷頭取材;甲醛+ NS組( F+NS )、甲醛+ L-NAME 0.5μmol組( F+L-NAME 0.5μmol )、甲醛+ L-NAME 2μmol組(F+L-NAME 2μmol)和甲醛+ L-NAME 4μmol組(F+L- NAME 4μmol)動(dòng)物,于注射甲醛前分別鞘內(nèi)注射10μl NS溶液和10μl L-NAME溶液(分別含0.5μmol、2μmol、4μmol L-NAME),于注射甲醛后,首先計(jì)數(shù)1 hour內(nèi)縮足次數(shù),然后于注射甲醛后3d斷頭取材。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測脊髓神經(jīng)元凋亡率,應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察脊髓后角神經(jīng)元p53蛋白的表達(dá)。 結(jié)果結(jié)果發(fā)現(xiàn):鞘內(nèi)注射L-Arg溶液后,動(dòng)物出現(xiàn)了嘶叫,煩躁不安,易激惹現(xiàn)象,表明動(dòng)物出現(xiàn)了傷害性反應(yīng)。動(dòng)物足低注射甲醛后立即出現(xiàn)嘶叫,縮足,舔咬注射部位等自發(fā)痛反應(yīng)行為。F組與F+NS兩組之間相比,第一相和第二相每5分鐘的縮足次數(shù)均無顯著性差異。甲醛+不同劑量L-NAME(0.5μmol、2μmol、4μmol)組動(dòng)物鞘內(nèi)注射L-NAME后,可劑量依賴性抑制甲醛誘導(dǎo)的傷害性反應(yīng),表現(xiàn)為第一、二相自發(fā)縮足次數(shù)顯著降低(P0.01)。 L-Arg組脊髓神經(jīng)元凋亡率高于對照組水平。F組及F+NS組脊髓神經(jīng)元凋亡率均明顯高于對照組(P0.05),但兩組之間無顯著性差異。與F+NS組相比,F+ L-NAME 0.5μmol組、F+L-NAME 2μmol和F+L-NAME 4μmol組L4～5脊髓節(jié)段神經(jīng)元的凋亡率均明顯降低,L-NAME劑量越大,神經(jīng)元的凋亡率降低越顯著。 Control組大鼠L4～5脊髓后角可見少量散在的p53免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞,p53免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞胞體多為橢圓形或不規(guī)則三角形,周圍有明顯的突起和纖維,符合神經(jīng)元特征。這些細(xì)胞染色較淺,左右兩側(cè)無明顯差異;與control組相比,L-Arg組脊髓后角神經(jīng)元Ⅰ~Ⅱ板層p53免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增加,染色加深;與control組相比,F組及F+NS組大鼠注射側(cè)脊髓后角神經(jīng)元Ⅰ~Ⅱ板層、Ⅲ~Ⅵ板層p53陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P0.05),染色明顯加深,即灰度值明顯降低(P0.05),注射同側(cè)脊髓后角內(nèi)p53陽性細(xì)胞數(shù)量及染色深度均高于對側(cè)(P0.05),相同側(cè)相比,兩組之間無顯著性差異。與F+NS組相比,甲醛+L-NAME各劑量組脊髓后角神經(jīng)元p53陽性細(xì)胞數(shù)量和陽性細(xì)胞染色深度均明顯降低,L-NAME的劑量越大,其陽性細(xì)胞的數(shù)量及染色深度的降低程度越明顯。 以上結(jié)果表明,鞘內(nèi)注射L-Arg可使正常大鼠出現(xiàn)自發(fā)痛反應(yīng),可引起大鼠脊髓后角神經(jīng)元p53蛋白表達(dá)增加并誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡;預(yù)先鞘內(nèi)注射L-NAME,可劑量依賴性抑制甲醛炎性痛誘導(dǎo)的大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡及脊髓后角神經(jīng)元p53蛋白的表達(dá),提示炎性痛時(shí)脊髓后角NOS的活性增強(qiáng)以及NO生成過多參與了神經(jīng)元凋亡的誘導(dǎo)過程。本實(shí)驗(yàn)還證實(shí),促進(jìn)p53蛋白表達(dá)可能是NO誘導(dǎo)脊髓后角神經(jīng)元凋亡的重要環(huán)節(jié)之一。 結(jié)論甲醛炎性痛可誘導(dǎo)大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡,注射甲醛后3d神經(jīng)元凋亡達(dá)高峰。炎性痛時(shí)脊髓后角NO產(chǎn)生增多參與了神經(jīng)元凋亡的誘導(dǎo)過程。促進(jìn)p53蛋白表達(dá)可能是NO誘導(dǎo)脊髓后角神經(jīng)元凋亡的重要環(huán)節(jié)之一。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R363

【引證文獻(xiàn)】

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1 李寬;不同劑量的一氧化氮對福爾馬林致大鼠炎性行為痛反應(yīng)及脊髓背角Bcl-2/Bax表達(dá)的影響[D];山西醫(yī)科大學(xué);2010年

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本文編號：2393102