【摘要】： 目的觀察使用不同首次換液時間和不同獲取骨髓間充質(zhì)干細胞的方法對骨髓間充質(zhì)干細胞分化增殖的影響,分析其部分表型特征,為其在組織工程的應(yīng)用確立最佳培養(yǎng)方案;利用瓊脂糖預先鋪被培養(yǎng)皿的方法,使骨髓間充質(zhì)干細胞懸浮,探討在體外誘導骨髓間充質(zhì)干細胞失巢凋亡過程中Caspase-3的作用;在體外模擬細胞離體后的懸浮狀態(tài),初步建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外懸浮培養(yǎng)模型,為骨髓基質(zhì)干細胞的懸浮培養(yǎng)提供理論依據(jù)。 方法以6w齡SPF級大鼠為實驗對象,應(yīng)用不同首次換液時間,對原代骨髓間充質(zhì)干細胞進行培養(yǎng),分離純化大鼠骨髓MSCs,傳代擴增,測定生長曲線,形態(tài)學觀察,免疫細胞化學及圖像分析測定細胞表面抗原表達情況;通過對全骨髓細胞貼壁培養(yǎng)法、改良全骨髓貼壁法、溶血純化法和密度梯度離心法進行比較性研究,對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞克隆形成率、貼壁細胞數(shù)測定、首次傳代時間、培養(yǎng)成功率和臺盼藍染色等指標進行比較;應(yīng)用Caspase-3活性檢測試劑盒,熒光比色法和Western blotting法檢測失巢凋亡中Caspase-3活性的改變;借助流式細胞儀分析骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡的變化。 結(jié)果首次換液時間為6h時,骨髓間充質(zhì)干細胞有效貼壁,并且可以加快骨髓間充質(zhì)干細胞的純化過程,其子代細胞生長曲線基本一致,增殖速度快。細胞呈均一的成纖維細胞樣,均一表達CD44、CD71但是不表達CD34分子;全骨髓貼壁培養(yǎng)法組和改良骨髓細胞貼壁法組的細胞貼壁所需要的時間較其他兩組最短;溶血純化法組和密度梯度離心法組所獲得的細胞較單一;全骨髓貼壁培養(yǎng)法組在原代培養(yǎng)第四天形成的平均克隆數(shù)為4.67;改良骨髓細胞貼壁法組為17.67;溶血純化法組為3.67;密度梯度離心法組為4.33;改良骨髓細胞貼壁法組與其他組相比具有統(tǒng)計學顯著性差異(p0.05)。全骨髓貼壁培養(yǎng)法組和改良骨髓細胞貼壁法組在第1d的貼壁細胞數(shù)量明顯高于其他兩組,具有統(tǒng)計學顯著性差異(p0.05);第4d時各組之間貼壁細胞數(shù)的差別不大,在統(tǒng)計學方面沒有顯著性差異。第7d和第10d時改良骨髓細胞貼壁法組和密度梯度離心法組的貼壁細胞數(shù)明顯高于溶血純化法組(p0.05)。在各實驗組中改良骨髓細胞貼壁法組的首次傳代所需時間最短,為6天,進行首次傳代的平均時間為8.17天;溶血純化法組首次傳代的平均時間最長,11.75天。改良骨髓細胞貼壁法組和密度梯度離心法組的培養(yǎng)成功率為100%,溶血純化法組的最低,為66.67%。全骨髓貼壁培養(yǎng)法組中被臺盼藍染料著色的細胞數(shù)平均有301.5個,細胞存活率為39.7%;改良骨髓細胞貼壁法組的著色細胞數(shù)平均為325個,細胞存活率為35%;溶血純化法組的著色細胞數(shù)平均為306.5個,細胞存活率為38.7%;密度梯度離心法組的著色細胞數(shù)平均為333個,細胞存活率為33.4%,各組在統(tǒng)計學方面沒有顯著性差異;骨髓間充質(zhì)干細胞在瓊脂糖的作用下有效懸浮;流式細胞術(shù)顯示誘導凋亡組出現(xiàn)了明顯的凋亡峰,凋亡率隨誘導時間的延長而明顯增加;其它兩組的凋亡率較低且較穩(wěn)定。Western blotting檢測和Caspase-3活性熒光檢測顯示,誘導凋亡組caspase-3的活性以及蛋白表達水平隨誘導凋亡時間的延長而明顯升高,且與細胞凋亡率相關(guān),以后者更靈敏,其余兩組其活性無明顯變化;Caspase-3抑制劑可以有效抑制其活性,使懸浮細胞的凋亡率明顯下降。 結(jié)論本實驗改良了一種體外分離純化、培養(yǎng)擴增大鼠骨髓骨髓間充質(zhì)干細胞的方法,經(jīng)免疫組化細胞表型分析,所獲細胞為純化的骨髓間充質(zhì)干細胞;應(yīng)用瓊脂糖可以使骨髓間充質(zhì)干細胞有效懸浮;caspase-3蛋白在誘導骨髓間充質(zhì)干細胞失巢凋亡的過程中發(fā)揮著重要作用;抑制Caspase-3的活性可以有效降低細胞失巢凋亡率,達到初步建立懸浮培養(yǎng)模型的目的。
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【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R329

【參考文獻】

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本文編號：2363681