【摘要】： 機體在各種應激或某些藥物的影響下糖皮質(zhì)激素-糖皮質(zhì)激素受體(GC-GR)效應會發(fā)生顯著的改變。而熱休克蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)是體內(nèi)普遍存在、高度保守的一類分子伴侶蛋白,也是GC-GR效應中的重要伴侶蛋白。正常情況下熱休克蛋白90與糖皮質(zhì)激素受體以及其他伴侶蛋白如HSP70、HIP、HOP、HSP40結合形成多聚體,使受體形成適合配體糖皮質(zhì)激素結合的活性結構,當配體進入細胞內(nèi)和受體特異結合,熱休克蛋白就從復合物中解離出來,GC-GR復合物便進入核內(nèi)發(fā)揮其生物效應。因此,熱休克蛋白90作為Gc-GR效應通路中關鍵環(huán)節(jié),其結構和數(shù)量的變化將會影響糖皮質(zhì)激素生物效應的發(fā)揮。 研究表明同系不同株的小鼠BALB/C和C57BL/6不但在創(chuàng)傷后表現(xiàn)出炎癥反應和創(chuàng)傷修復的差異,且在耐熱、耐機械、抗輻射損傷和免疫反應方面表現(xiàn)出顯著差異。同樣,在臨床上也可見到用糖皮質(zhì)激素治療的相同疾病的患者對于同樣劑量的激素治療的敏感性也有不同,有證據(jù)表明遺傳因素在這一過程中扮演重要角色,如GR的基因變異會導致激素治療敏感性的差異,但僅少數(shù)患者檢測到GR的基因突變。上述過程都與GC-GR效應密切相關,而HSP90是GC-GR效應通路中的重要分子,它的變化與GC-GR效應差異的關系引起了我們的關注。本室前期的實驗發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠較BALB/C具有較強的應激耐受能力,隨后對其HSP84(相當于人HSP90β)基因全長進行了測序,發(fā)現(xiàn)了4個有意義突變位點,這是否與前面所觀察到的應激耐受差異有關?本室對此做了進一步研究,首先檢測了全身沖擊傷(systemic blast injury,SBI)應激模型條件下兩品系小鼠HSP84的表達量有無差異,并將C57BL/6小鼠的HSP84基因轉入BALB/C成纖維細胞,觀察其在熱應激后糖皮質(zhì)激素受體的核轉位變化情況。結果表明,SBI應激條件下,兩品系小鼠的HSP84表達均有顯著升高,但品系間無顯著差異;但轉入C57BL/6小鼠的HSP84基因的BALB/C成纖維細胞較轉入BALB/C小鼠HSP84基因和轉入空質(zhì)粒的同種細胞具有更強的核轉位能力。因此,我們推測HSP84基因的結構變化對GC-GR效應有顯著的影響。 由于有較多的分子參與GC-GR效應通路,為排除其他分子的影響,本課題將以遺傳背景相似的BALB/C和C57BL/6成纖維細胞為研究對象,采用熱應激模型觀察在給予藥物阻斷熱休克蛋白90的情況下GC-GR效應的差異及其變化,驗證HSP90基因差異是引起應激效應差異的重要原因之一。同時,我們將收集大批量經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療的原發(fā)性腎病綜合征(primary nephrotic syndrome,PNS)病例,通過特異性擴增HSP90β基因的二聚化區(qū)域和核轉位區(qū)域進行基因測序,篩查HSP90基因突變,確定GC治療敏感和不敏感各組PNS患者各種基因型的發(fā)生率,確定基因多態(tài)性與GC治療敏感差異性的關系。 主要研究內(nèi)容和結果如下: 1.采用C57BL/6和BALB/c小鼠成纖維細胞42℃熱應激模型,該模型具有穩(wěn)定性好,致傷均一,重復性好,便于操作等優(yōu)點,并且避免了細胞的污染。 2. C57BL/6和BALB/c小鼠成纖維細胞在42℃熱損傷情況下的細胞存活率、細胞增殖活力均較正常對照組減弱,LDH釋放增加,GR核轉位明顯增強,并且兩品系小鼠成纖維細胞之間有顯著差異,結果表明C57BL/6小鼠成纖維細胞具有更強的熱損傷耐受力。 3.熱應激小鼠成纖維細胞在給予地塞米松50nM后, C57BL/6和BALB/c小鼠成纖維細胞的損傷明顯減輕,GR核轉位明顯增強,提示地塞米松可通過增強GR核轉位對熱應激小鼠有保護作用,對C57BL/6小鼠成纖維細胞的保護作用強于BALB/c小鼠。 4.在給予熱應激小鼠成纖維細胞地塞米松50nM的同時給予HSP90特異性抑制劑格爾德霉素后,地塞米松對兩品系小鼠成纖維細胞的保護作用均被減弱。較低劑量0.1uM時BALB/c小鼠成纖維細胞的損傷較C57BL/6小鼠更為嚴重,兩品系小鼠間有顯著差異。較高劑量1uM和10uM時,GR核轉位明顯受阻,但兩品系小鼠成纖維細胞間僅LDH釋放有顯著差異,其余指標無明顯差異,表明當HSP90被完全阻斷后,兩品系小鼠成纖維細胞間的熱應激耐受差異就消失,提示HSP90是導致這種差異的重要原因之一。 5.通過特異性擴增HSP90β基因的二聚化區(qū)域和核轉位區(qū)域(6923bp-7803bp,參考Genebank Accession number:J04988)并進行基因測序,發(fā)現(xiàn)在經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療的腎病綜合征患者中存在2個位點基因變異,分別為位于intron 10的7489 CT和3’非編碼區(qū)的7612 CT基因突變。 6.在被檢測的經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療的155例腎病綜合征患者中包括激素治療敏感患者85例和不敏感患者70例,其HSP90β基因7489 CT突變的頻率分別為2.4%和4.3%,突變位點多態(tài)性分布無統(tǒng)計學差異(P 0.6)。HSP90β基因7612 CT突變的頻率分別為2.4%和2.9% ,突變位點多態(tài)性分布無統(tǒng)計學差異(P 0.5)。以上結果提示HSP90β表達量與GC治療敏感性無顯著相關,因為HSP90β非翻譯區(qū)突變只影響表達量,推測HSP90β的含量變化與激素治療敏感性無關,而HSP90β的結構變化可能是引起糖皮質(zhì)激素治療敏感性差異的主要因素,但結構差異來自基因的何處突變還需進一步的研究。
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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R362

【參考文獻】

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1 張杰;熱休克蛋白及其生物學功能(文獻綜述)[J];國外醫(yī)學.外科學分冊;2003年05期

2 馮剛,王正國,楊志煥,朱佩芳,周立雄,李曉炎,寧心,肖凱,張良,蔣建新;C57BL/6和BALB/C小鼠創(chuàng)傷反應差異性初步探討[J];中華創(chuàng)傷雜志;2001年05期

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本文編號：2341575