【摘要】： 【研究背景及目的】 Src抑制的蛋白激酶C的底物(Src Suppressed C Kinase Substrates，SSeCKS)是1995年發(fā)現(xiàn)的細胞支架蛋白，屬于蛋白激酶A錨定蛋白超家族(A Kinase Anchoring Protein，AKAP)中的成員。SSeCKS的分子量為280／290kD，其氨基端有膜定位序列和蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)結(jié)合位點，羧基端有蛋白激酶A(Protein Kinase A，PKA)結(jié)合位點。SSeCKS廣泛表達于平滑肌細胞、腎小球系膜細胞、星形膠質(zhì)細胞、成纖維細胞和血管的內(nèi)皮細胞(Endothelial Cell，EC)等。對SSeCKS功能研究發(fā)現(xiàn)：SSeCKS通過錨定細胞周期蛋白D1(CyclinD1)控制G1／S期進程而調(diào)節(jié)有絲分裂；通過錨定PKC而參與肌動蛋白為基礎的細胞骨架的調(diào)節(jié)。對SSeCKS分子表達與疾病相關性的研究發(fā)現(xiàn)：內(nèi)毒素血癥模型中脾臟、肝臟、淋巴結(jié)的EC中SSeCKS表達上調(diào)。 為進一步明確EC中SSeCKS所參與的生物學功能，及炎癥刺激EC SSeCKS表達上調(diào)的意義，本課題首先研究了SSeCKS與EC增殖、粘附和遷移的關系；其次研究了SSeCKS與炎癥的相關性；最后研究了SSeCKS與炎癥刺激EC骨架結(jié)構(gòu)改變的關系。 本研究在初步分析SSeCKS參與EC有關功能的基礎上，發(fā)現(xiàn)SSeCKS參與炎癥刺激后EC骨架結(jié)構(gòu)的改變，并對其作用機制進行了初步探討。本課題的開展可能為臨床上認識膿毒血癥等炎癥引起血管通透性增加的機理及治療提供新的思路。 【方法】 (1)用纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)包被六孔板，通過免疫印跡(Western blotting)檢測SSeCKS在EC黏附過程中的表達情況，免疫熒光法檢測SSeCKS在EC遷移過程中的定位情況，流式細胞儀分析EC細胞周期，并檢測相應細胞周期中SSeCKS的表達情況。 (2)應用BALB／c小鼠腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)建立內(nèi)毒素血癥模型，分別在1mg／kg、5mg／kg、10mg／kg、15mg／kg LPS腹腔注射后8h處死小鼠取肺組織，或在5mg／kg LPS腹腔注射后0、1、3、8、12、24h處死小鼠取肺組織。蘇木素伊紅(Hematoxylin and eosin，HE)染色觀察小鼠肺組織病理學改變情況；實時定量PCR(Real Time-PCR)檢測肺組織SSeCKS在mRNA水平的表達；原位雜交檢測SSeCKS mRNA在肺組織中的定位情況；Western blotting檢測肺組織SSeCKS在蛋白質(zhì)水平的表達變化；免疫熒光雙標法觀察肺組織SSeCKS的細胞定位。 (3)分別應用LPS、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factorα，TNF-α)、白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)刺激大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞(Rat Pulmonary Microvessel Endothelial Cell，RPMVEC)及人臍靜脈內(nèi)皮細胞株ECV304，并根據(jù)刺激時間和刺激劑量的不同分批收集細胞。Real time-PCR法檢測SSeCKS mRNA水平的表達情況；原位雜交法檢測SSeCKS mRNA在細胞中的定位；Western blotting檢測SSeCKS蛋白質(zhì)水平的表達變化；免疫熒光法檢測SSeCKS在細胞中的定位情況和F-actin的改變情況。構(gòu)建SSeCKS siRNA干擾質(zhì)粒，并應用SSeCKS siRNA干擾質(zhì)粒封閉內(nèi)源性SSeCKS的表達；Western blotting檢測SSeCKS siRNA對ERK信號通路的影響；免疫熒光檢測SSeCKS siRNA對細胞骨架的影響。 實驗結(jié)果以(?)±s表示，用STAT 8．0軟件進行One-Way-ANOVA分析，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls(S-N-K)檢驗。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。 【結(jié)果】 (1)FN能夠顯著誘導EC粘附和遷移，SSeCKS的表達量也隨之增加，具有時間和劑量依賴性關系，且SSeCKS在細胞層狀偽足聚集；經(jīng)PKC抑制劑(Ro31-8220、Calphostin C)處理細胞后，細胞黏附率和遷移細胞數(shù)較處理前顯著減少，SSeCKS在細胞內(nèi)散在分布，且纖維肌動蛋白(Filament actin，F(xiàn)-actin)骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生重組，SSeCKS在內(nèi)皮細胞增殖后期表達增加。 (2)SSeCKS的表達水平與LPS用量呈現(xiàn)劑量和時間依賴關系：在1、5、10和15mg／kg組SSeCKS mRNA水平的表達量皆顯著高于對照組(P＜0.05)，且隨LPS注射劑量增高，SSeCKS mRNA表達量亦逐漸增高；而不同時相中，LPS(5mg／kg)注射后肺組織中SSeCKS mRNA水平表達呈動態(tài)變化過程，1h開始增高，3h達到表達高峰，12h降至正常水平；SSeCKS蛋白水平表達變化與mRNA水平變化相一致。SSeCKS在肺組織中定位于肺泡間隔毛細血管EC。 (3)LPS、TNF-α、IL-1β以時間依賴的方式誘導EC中SSeCKS表達增加；經(jīng)LPS、TNF-α和IL-1β刺激后，F(xiàn)-actin發(fā)生重構(gòu)，SSeCKS向核周、細胞膜纖維狀、板狀偽足聚集；PKC抑制劑Calphostin C可抑制LPS、TNF-α和IL-1β對內(nèi)皮細胞F-actin和SSeCKS細胞內(nèi)定位改變的影響。細胞免疫熒光和Western blotting檢測顯示SSeCKS siRNA能夠顯著下調(diào)SSeCKS蛋白水平的表達(P＜0.05)，引起一系列變化：EC骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細胞內(nèi)應力纖維增粗增多；LPS、TNF-α和IL-1β刺激EC引起的骨架結(jié)構(gòu)改變受到抑制；LPS、TNF-α和IL-1β刺激EC后ERK磷酸化受到抑制。 【結(jié)論】 (1)SSeCKS在EC粘附、遷移過程中的表達和細胞內(nèi)定位發(fā)生改變，提示了SSeCKS可能通過細胞骨架結(jié)構(gòu)的改變，在EC粘附、遷移過程中發(fā)揮重要作用。SSeCKS在內(nèi)皮細胞增殖后期表達增加提示SSeCKS可能參與內(nèi)皮細胞周期的負性調(diào)控。 (2)內(nèi)毒素以時間和劑量依賴的方式誘導肺組織SSeCKS表達上調(diào)，，提示SSeCKS作為PKC的底物，在PKC信號途徑參加炎癥反應中，可能具有一定的意義。 (3)LPS、TNF-α和IL-1β能誘導EC中F-actin重構(gòu)及SSeCKS表達和亞定位發(fā)生改變；抑制PKC活性和封閉內(nèi)源性SSeCKS表達均可阻斷LPS、TNF-α和IL-1β誘導的EC骨架結(jié)構(gòu)改變，并使ERK的磷酸化水平增高受抑制。這提示SSeCKS可能通過與PKC結(jié)合，參與炎癥刺激EC骨架結(jié)構(gòu)改變。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R392

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本文編號：2319954