發(fā)布時間：2018-10-26 21:04

【摘要】： 【背景與目的】在眾多的免疫避孕候選抗原中，精子抗原被認為是目前最有希望和最具應用前景的避孕疫苗靶抗原。2005年，一種新的精子特異表達的精卵融合關鍵蛋白Izumo的發(fā)現(xiàn)可能為避孕疫苗的研究提供了新思路和新材料。本課題旨在研究原核表達的重組小鼠Izumo(mlzumo)蛋白的免疫避孕潛力，為重組mlzumo蛋白是否能作為避孕疫苗候選靶抗原提供實驗數(shù)據(jù)和科學依據(jù)。 【材料與方法】①構建pET28a(+)-mlzumo原核表達質粒；②在大腸桿菌中表達帶有6His純化標簽的重組蛋白6His-mlzumo；③固化Ni~(2+)親和層析純化重組蛋白6His-mIzumo，，并透析復性和Bradford法定量；④通過腹腔注射用6His-mIzumo免疫雌雄性C57BL／6小鼠；⑤Western blot檢測免疫小鼠血清抗6His-mlzumo IgG抗體的特異性；⑥ELISA檢測血清特異性抗體滴度隨免疫時間變化的規(guī)律；⑦精卵融合試驗觀察免疫血清對小鼠體外精卵融合的影響；⑧雙熒光染色法對抗6His-mlzumo IgG抗體在精子上的識別部位進行定位；⑨免疫小鼠在末次免疫后第2周與正常小鼠合籠，評價其生育力。 【結果】①成功構建了pET28a(+)-mIzumo原核表達質粒；②成功表達和得到了純化的重組蛋白6His-mlzumo；③雌性和雄性免疫小鼠體內都能產生血清特異性抗6His-mIzumoIgG抗體，特異性抗體與天然mlzumo存在交叉反應；④血清特異性抗6His-mIzumo IgG抗體開始出現(xiàn)在第一次加強免疫后第2周，末次免疫后第2周抗體滴度達到最高并至少持續(xù)到末次免疫后第6周；⑤6His-mlzumo免疫血清完全阻斷小鼠體外精卵融合的發(fā)生；⑥抗6His-mlzumo IgG抗體特異地識別的小鼠AR精子(發(fā)生了頂體反應的精子)頭部頂體區(qū)；⑦雌性和雄性免疫小鼠的生育力與PBS對照組相比沒有明顯降低。 【結論】通過pET原核表達系統(tǒng)成功制備帶有6His純化標簽的重組蛋白6His-mlzumo：6His-mlzumo對于雌性和雄性小鼠都具有免疫原性；雖然免疫重組mlzumo蛋白能夠使小鼠產生特異識別小鼠AR精子頭部頂體區(qū)并能阻斷體外精卵融合的血清特異性IgG抗體，但對雌性和雄性免疫小鼠生育力的影響不明顯。因此，原核表達的重組mlzumo蛋白可能對免疫小鼠沒有明顯的避孕作用，Izumo是否能作為避孕疫苗研制的靶抗原還需要進一步的研究和探索。
[Abstract]:[background & objective] among the many candidate antigens for immune contraception, sperm antigens are considered to be the most promising and promising target antigens for contraceptive vaccine. The discovery of a new spermatozoa specifically expressed spermatozoa fusion key protein Izumo may provide new ideas and materials for the study of contraceptive vaccine. The purpose of this study was to study the immunological potential of recombinant mouse Izumo (mlzumo) protein expressed in prokaryotic cells, and to provide experimental data and scientific basis for whether recombinant mlzumo protein can be used as candidate antigen for contraceptive vaccine. [materials and methods] 1 to construct pET28a ()-mlzumo prokaryotic expression plasmid, 2 to express the recombinant protein 6His-mlzumo with 6His purified label in Escherichia coli. 3Recombinant protein 6His-mIzumo was purified by immobilized Ni~ (2) affinity chromatography, and refolded by dialysis and measured by Bradford assay. (4) female and male C57BL/6 mice were immunized by intraperitoneal injection of 6His-mIzumo, and the specificity of anti-6His-mlzumo IgG antibody in serum of immunized mice was detected by 5Western blot. The changes of serum specific antibody titer with immune time were detected by 6ELISA, and the effect of immunized serum on mouse spermatozoa fusion in vitro was observed by sperm-egg fusion test. (8) double fluorescent staining was used to locate the recognition site of 6His-mlzumo IgG antibody on sperm, and 9 mice were incubated with normal mice at the 2nd week after the last immunization to evaluate their fertility. [results] 1 the prokaryotic expression plasmid of pET28a ()-mIzumo was successfully constructed, 2 the recombinant protein 6His-mlzumo was successfully expressed and purified. (3) in both female and male immunized mice, serum specific anti 6His-mIzumoIgG antibodies were produced, and there was a cross reaction between the specific antibodies and natural mlzumo. (4) the serum specific anti 6His-mIzumo IgG antibody began to appear at the second week after the first immunization, and the titer of the antibody reached the highest level at the second week after the last immunization and lasted until at least 6 weeks after the last immunization. 56His-mlzumo immune serum completely blocked the development of mouse spermatozoa fusion in vitro. 6) the acrosome region of mouse AR sperm (sperm with acrosome reaction) was specifically recognized by anti 6His-mlzumo IgG antibody. The fertility of female and male immunized mice was not significantly lower than that of PBS control group. [conclusion] the recombinant protein 6His-mlzumo:6His-mlzumo with 6His purified label was successfully prepared by pET prokaryotic expression system for both female and male mice. Although the recombinant mlzumo protein can make mice produce specific serum-specific IgG antibodies that specifically recognize the acrosome region of mouse AR sperm head and block the fusion of spermatozoa in vitro, the effect on fertility of female and male immunized mice is not obvious. Therefore, the recombinant mlzumo protein expressed in prokaryotic cells may not have significant contraceptive effect on immunized mice. Whether Izumo can be used as the target antigen of contraceptive vaccine should be further studied and explored.
【學位授予單位】：汕頭大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R392

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本文編號：2296937