【摘要】： 糖尿病是胰島素分泌的相對或絕對不足引起的一種代謝障礙性疾病,部分患者需要依靠注射外源胰島素來維持生命。外源胰島素以前主要從動物胰臟中提取,但動物胰島素由于本身和人胰島素氨基酸組成上的差異,有很大的副作用,給患者帶來極大痛苦。隨著分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展,利用生物工程技術(shù)生產(chǎn)副作用小、更高效的人胰島素以及人胰島素類似物,成為了一大熱點。但在利用大腸桿菌等微生物表達(dá)生產(chǎn)胰島素的過程中,表達(dá)產(chǎn)物常常形成包涵體,要通過變性和復(fù)性過程才能得到有活性的人胰島素,這給后續(xù)分離和純化帶來很大不便,同時也影響目的蛋白的最終產(chǎn)量。本研究希望通過合理的設(shè)計、表達(dá)系統(tǒng)的選擇及發(fā)酵條件的優(yōu)化使胰島素原基因以可溶形式表達(dá),同時建立方便有效的純化工藝。 本實驗選用pET32-a載體,BL21大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏嗜性,在胰島素原基因N端設(shè)計腸激酶位點,合成人胰島素原基因寡核苷酸片段,通過片段連接和PCR擴(kuò)增得到胰島素原基因。采用亞克隆的方式先將胰島素原基因連接到pMD 18-T載體,經(jīng)測序,將測序正確的人胰島素原基因整合到pET32-a載體,構(gòu)建表達(dá)載體,用測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21,構(gòu)建基因工程菌,使胰島素原基因和硫氧還蛋白融合表達(dá),同時帶有6XHis標(biāo)簽,可以利用親和層析對表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行分離純化。 實驗中對工程菌的培養(yǎng)溫度和IPTG誘導(dǎo)濃度進(jìn)行優(yōu)化。通過實驗,工程菌在300C條件下培養(yǎng)和在終濃度0.6mM IPTG條件下誘導(dǎo),表達(dá)產(chǎn)物破菌后在上清。證明目的蛋白是以可溶形式進(jìn)行表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE和Westen blotting檢測,表達(dá)的蛋白分子量與理論分子量一致,并且具有胰島素的免疫原性,證明胰島素原基因得到了正確表達(dá)。 對表達(dá)的重組人胰島素原的分離純化步驟研究得到了優(yōu)化的分離步驟組合和分離條件。發(fā)酵液離心收集菌體,破菌后上清液過金屬螯合層析柱,再過離子交換柱分離純化目的蛋白。透析后樣品用腸激酶和羧肽酶酶切,過親和柱,除去融合蛋白、6XHis標(biāo)簽,凝膠層析分離胰島素與連接肽,收集胰島素樣品液。 利用免疫酶標(biāo)法,lmL樣品測得活性102μIU,證明實驗所得樣品具有人胰島素活性。
[Abstract]:Diabetes mellitus is a metabolic disorder caused by relative or absolute insufficiency of insulin secretion. Exogenous insulin was mainly extracted from animal pancreas before, but the difference of amino acid composition between animal insulin and human insulin caused great side effects, which caused great pain to patients. With the rapid development of molecular biology and genetic engineering technology, the production of human insulin and its analogues by bioengineering technology has become a hot topic. However, in the process of using E. coli and other microorganisms to express and produce insulin, the expression products often form inclusion bodies, and the active human insulin can only be obtained through denaturation and renaturation, which brings great inconvenience to the subsequent separation and purification. It also affects the final yield of the target protein. The aim of this study was to make proinsulin gene expressed in soluble form by reasonable design, selection of expression system and optimization of fermentation conditions, and to establish a convenient and effective purification process. In this experiment, pET32-a vector and BL21 Escherichia coli expression system were selected. According to the codon bias of Escherichia coli, the enterokinase site was designed at the N-terminal of proinsulin gene, and the oligonucleotide fragment of human proinsulin gene was synthesized. The proinsulin gene was obtained by ligation and PCR amplification. The proinsulin gene was first ligated to pMD 18-T vector by subcloning. After sequencing, the correctly sequenced human proinsulin gene was integrated into the pET32-a vector, and the expression vector was constructed. The recombinant plasmid was transformed into BL21, by sequencing the correct recombinant plasmid. The recombinant bacteria were constructed to express proinsulin gene and thioredoxin with 6XHis tag. The expressed target protein could be separated and purified by affinity chromatography. In the experiment, the culture temperature and IPTG induction concentration of engineering bacteria were optimized. The engineering bacteria were cultured at 300C and induced under the final concentration of 0.6mM IPTG. The expression product was expressed in the supernatant after breaking the bacteria. It is proved that the target protein is expressed in soluble form. SDS-PAGE and Westen blotting analysis showed that the molecular weight of the expressed protein was consistent with the theoretical molecular weight and had the immunogenicity of insulin, which proved that the proinsulin gene was correctly expressed. The separation and purification of recombinant human proinsulin were studied. The bacteria were collected by centrifugation, the supernatant was separated by metal chelate chromatography column, and the target protein was purified by ion exchange column. After dialysis, the samples were digested with enterokinase and carboxypeptidase, the affinity column was used to remove the fusion protein, the 6XHis label was removed, and the insulin and conjugated peptides were separated by gel chromatography, and the insulin sample solution was collected. The activity of lmL samples was 102 渭 IU, which showed that the samples had human insulin activity.
【學(xué)位授予單位】：四川師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R587.1;R341

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