【摘要】： 缺氧(hypoxia)是一種常見的病理過程。雖然不同類型細胞對缺氧的敏感性不同,但是,隨著缺氧嚴重程度和持續(xù)時間的增加,最終都會引起細胞的代謝和功能障礙,甚至死亡。細胞為了對抗這種缺氧損傷反應(yīng),可以通過氧感受器和相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),啟動一系列內(nèi)源性保護機制。大量研究結(jié)果提示,缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia induciblefactor-1,HIF-1)可能是這種內(nèi)源性保護機制的中心環(huán)節(jié),但有關(guān)作用機制尚不十分清楚。 HIF-1是介導(dǎo)缺氧信號與眾多缺氧誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄激活的一個重要的耦聯(lián)和調(diào)控因子,對于低氧環(huán)境中細胞的生存具有重要意義。HIF-1作為反式作用因子與細胞核染色體上的順式作用元件(缺氧反應(yīng)元件)相互作用,調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。這些基因產(chǎn)物可通過提高糖酵解效率、促進血管生成和增加葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種途徑來維持細胞在缺氧環(huán)境中的生存,對抗缺氧損傷。有關(guān)HIF-1及調(diào)控基因表達產(chǎn)物功能及作用的研究是當前的前沿和熱點。現(xiàn)在還有一些新HIF-1調(diào)控的基因被不斷發(fā)現(xiàn),說明HIF-1抗缺氧損傷的發(fā)生是多因素、多步驟、綜合作用的結(jié)果。為了研究HIF-1對缺氧損傷的保護作用及其發(fā)生機制,我們應(yīng)用基因同源重組原理,構(gòu)建了能介導(dǎo)HIF-1α基因轉(zhuǎn)染和表達的復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體Ad—HIF-1α;通過腺病毒中介外源基因HIF-1α在細胞內(nèi)的高表達,從細胞水平研究復(fù)制缺陷型腺病毒Ad—HIF-1α對細胞缺氧損傷的保護作用,并用分子生物學(xué)方法和基因芯片技術(shù)對其作用機制進行初步探討。 方法: 1.利用基因同源重組技術(shù),采用pAdEasy腺病毒系統(tǒng)構(gòu)建HIF-1α重組腺病毒(Ad—HIF-1α)和對照腺病毒(Ad—GFP)。通過GFP熒光表達、PCR等方法鑒定構(gòu)建的腺病毒載體并測定重組腺病毒的滴度。 2.重組腺病毒Ad—HIF-1α轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的HepG2細胞,應(yīng)用RT-PCR和WesternBlot等方法觀測目的基因在HepG2細胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯。 3.HepG2細胞常氧培養(yǎng)24h后,分為4組:①對照腺病毒轉(zhuǎn)染常氧組(CC組):換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),加入對照腺病毒(MOI=75),繼續(xù)常氧培養(yǎng)48h;②HIF-1α腺捕咀，

本文編號：2252883