發(fā)布時間：2018-08-28 14:47

【摘要】：骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)是破骨細(xì)胞分化因子(receptor activator of nuclear factor-κ B ligand,RANKL)的可溶性“誘騙”受體,能抑制破骨細(xì)胞的分化、成熟、活化及存活。它是一種分泌性糖蛋白,含21個信號肽和5個潛在的糖基化位點(diǎn)。成熟人OPG由7個結(jié)構(gòu)域組成,其中N-端有4個半胱氨酸富集結(jié)構(gòu),也是其生物活性所在部位。最初OPG以單體形式在細(xì)胞內(nèi)生成,再在第400個半胱氨酸(Cys400)的位置以二硫鍵連成二聚體。 目前,雖有原核表達(dá)OPG的報道,但仍存在一些不足。例如,在大腸桿菌中表達(dá)真核蛋白,不能進(jìn)行翻譯后修飾,諸如不能完成蛋白的糖基化、磷酸化和二硫鍵的形成等,所以很難制得具備天然活性的蛋白質(zhì)。真核細(xì)胞能夠表達(dá)具有生物功能的OPG,但存在的普遍問題是表達(dá)量不高。近年本室成功構(gòu)建了OPG的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/DHFR-OPG,轉(zhuǎn)染CHO-dhfr~-細(xì)胞后獲得了表達(dá),但表達(dá)量不高,不能滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要。本次研究在于進(jìn)一步優(yōu)化已建立好的表達(dá)系統(tǒng),并進(jìn)一步對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免疫原性鑒定和生物活性測定。 本次研究將通過對目的基因和載體結(jié)構(gòu)進(jìn)行改進(jìn),以達(dá)到優(yōu)化表達(dá)的目的。在已有全長型人OPG重組哺乳類表達(dá)載體pcDNA3.1/DHFR-OPG的基礎(chǔ)上,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增截短型人OPGcDNA(含有21個信號肽序列、D1-D4結(jié)構(gòu)區(qū)和形成二硫鍵必需的Cys400),利用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ將其克隆入構(gòu)建好的帶有二氫葉酸還原酶篩選標(biāo)記的哺乳類表達(dá)載體pcDNA3.1/DHFR-GFP的相應(yīng)克隆位點(diǎn),構(gòu)建成pcDNA3.1/DHFR-tOPG。并嘗試對載體進(jìn)行優(yōu)化,以截短型OPG為模板,運(yùn)用兩次PCR技術(shù),在目的基因的5'端非翻譯區(qū)添加了一條長35bp的翻譯增強(qiáng)序列和一條長37bp的內(nèi)含子序列,構(gòu)建了表達(dá)載體pcDNA3.1/DHFR-netOPG。 按照Lipofectmine~(TM)2000 Reagent說明書將上述已線性化載體分別轉(zhuǎn)入二氫葉酸還原酶(Dihydrofolate Reductase,DHFR)基因缺陷的CHO細(xì)胞中,首先在
[Abstract]:Osteoprotegerin (osteoprotegerin, OPG) is a osteoclast differentiation factor (receptor activator of).
Nuclear factor-kappa B ligand (RANKL), a soluble "decoy" receptor, inhibits the differentiation, maturation, activation and survival of osteoclasts. It is a secretory glycoprotein containing 21 signal peptides and 5 potential glycosylation sites. Mature human OPG consists of seven domains, of which the N-terminal has four cysteine-rich structures and is also bioactive. Location. OPG is initially formed as a monomer in the cell and then linked to a dimer at the 400 th cysteine (Cys400) site by disulfide bonding.
For example, the expression of eukaryotic proteins in E. coli can not be modified after translation, such as glycosylation, phosphorylation and disulfide bond formation, so it is difficult to produce naturally active proteins. In recent years, we successfully constructed the eukaryotic expression vector pcDNA3.1/DHFR-OPG of OPG and transfected CHO-dhfr~ - cells to express OPG, but the expression level was not high enough to meet the needs of subsequent experiments. The immunogenicity and biological activity of the substance were determined.
Based on the existing full-length human OPG recombinant mammalian expression vector pcDNA3.1/DHFR-OPG, the truncated human OPG cDNA (containing 21 signal peptide sequences, D1-D4 domain and Cys400 essential for disulfide bond formation) was amplified by PCR. The restriction endonuclease EcoR I was cloned into the corresponding cloning site of the mammalian expression vector pcDNA3.1/DHFR-GFP with dihydrofolate reductase screening marker and constructed into pcDNA3.1/DHFR-tOPG. The expression vector pcDNA3.1/DHFR-netOPG was constructed by adding a 35 BP translation enhancement sequence and a 37 BP intron sequence.
According to the Lipofectmine ~ (TM) 2000 Reagent specification, these linearized vectors were transferred into CHO cells with dihydrofolate reductase (DHFR) gene defect, first in
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R346

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本文編號：2209699