本文選題：肺炎支原體 + P30　； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2005年碩士論文

【摘要】：第一部分 肺炎支原體 P30 蛋白的原核表達(dá)及初步分析 目的:通過體外擴(kuò)增 MP 的 P30 粘附素基因,構(gòu)建 P30 基因的原核表達(dá)質(zhì)粒,在 E.coli 中表達(dá)并鑒定;用親和層析法分離純化 rP30 蛋白;以純化的 rP30 蛋白為抗原建立間接 dolt-ELISA 法,用臨床病例評(píng)價(jià) rP30 蛋白在 MP 感染免疫學(xué)診斷中的價(jià)值;為探討 MP 的致病機(jī)制和臨床血清學(xué)診斷提供新的依據(jù)。 方法:用引物修飾法將 P30 基因中唯一的“UGA”碼突變?yōu)椤癠GG”后作為上游引物,并帶上 BamH I 的酶切位點(diǎn),下游引物帶 Sal I 位點(diǎn);以 MP 基因組 DNA 為模板,用 PCR 方法擴(kuò)增 P30 基因,將其定向克隆入 pET32a(+)質(zhì)粒,構(gòu)建 pET32a(+)/P30 重組體;測(cè)序鑒定正確后用重組體轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)菌,在 IPTG 誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá);表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE 鑒定后用陽性 MP 感染患兒血清做 Western-blot 檢測(cè)其抗原性;再用 Ni-NTA 樹脂純化,以純化并復(fù)性后的 rP30 蛋白為抗原建立間接 dolt-ELISA 法,對(duì) 40 份臨床疑似 MP 感染患兒血清進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié) 果 :成功擴(kuò)增出不含“UGA” 碼的P30基因并構(gòu)建出pET32a(+)/P30 重組質(zhì)粒。該重組體在適當(dāng) IPTG 誘導(dǎo)下,在 BL21(DE3)菌中表達(dá)出了分子量約為 52kD 的 Trx-P30 融合蛋白。重組蛋白以包 重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 5 涵體形式表達(dá),表達(dá)量約占全菌蛋白的 13%;經(jīng) Ni-NTA 樹脂純化后 得到了純度約為 93%的重組蛋白。Western-blot 證實(shí) rP30 蛋白可以和 陽性 MP 感染患兒血清發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。用 rP30 蛋白建立的間接 dolt-ELISA 法,其敏感性和特異性分別是:95.45%、72.22%,準(zhǔn)確度 為 85%。 結(jié)論:成功構(gòu)建出原核表達(dá)載體 pET32a(+)/P30;在 E.coli 中表達(dá) 出了完整的 MP P30 蛋白;rP30 蛋白具有良好的抗原性;經(jīng) Ni-NTA 樹脂純化后得到較高純度的目的蛋白;此重組蛋白為 MP 感染檢測(cè)用 抗原、抗體的選擇及 MP 感染致病機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。 第二部分 小鼠肺炎支原體肺炎模型的建立 目的:建立 BALB/C 小鼠的 MP 肺部感染模型,探索小鼠急性 MP 感染的過程。 方法:BALB/C 小鼠隨機(jī)分為Ⅰ、Ⅱ兩組,Ⅰ組在 0、1、2 天滴 鼻接種 MP 菌液 3 次,Ⅱ組在 0 天滴鼻接種小劑量 MP 菌液 1 次后于 8、9 天再接種和Ⅰ組相同的 MP 菌液 2 次,均設(shè)立不同劑量、批次的 生理鹽水對(duì)照組。全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在 3～18 天內(nèi)分批處死。所有小鼠均 取肺組織做病理切片。以組織病理學(xué)評(píng)分來確定小鼠的肺部炎癥反應(yīng) 程度。取肺組織勻漿及 BALF 進(jìn)行 MP 培養(yǎng)做病原學(xué)檢測(cè)。 結(jié)果:接種后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部存活無死亡例。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物均出現(xiàn)不 同程度的 MPP 樣病理改變,組織病理學(xué)評(píng)分為 1.5～14.3 分,分別于 第 5、6 天和第 11 天達(dá)到最高,平均分為 4.9 分;Ⅰ組實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物多
[Abstract]:Prokaryotic Expression and Preliminary Analysis of Mycoplasma Pneumoniae 30 Protein in the First Part








Objective : To construct a prokaryotic expression plasmid of p30 gene and to identify and identify the prokaryotic expression plasmid of p30 gene by amplifying MP gene in vitro . The purified r30 protein was isolated and purified by affinity chromatography . Indirect dolt - ELISA was established by affinity chromatography . The value of r30 protein in the diagnosis of MP infection was evaluated by clinical case .








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本文編號(hào)：2099832