本文選題：睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子 + 分子克隆　； 參考：《福建醫(yī)科大學》2005年碩士論文

【摘要】：目的: 利用分子生物學技術克隆大鼠睫狀神經(jīng)生長因子(CNTF)基因片段,構建腺相關病毒表達載體,為探討CNTF 對大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的影響奠定基礎。 方法: 1.采用基因拼接的方法克隆大鼠CNTF 的ORF(開放讀碼框)DNA 片段,所得的DNA 片段經(jīng)SalⅠ和XbaⅠ雙酶切后定向插入腺相關病毒載體AAV-MCS質(zhì)粒中構建成pAAV-CNTF。2.pAAV-CNTF 和另外兩種質(zhì)粒pHelper、pAAV-RC 通過脂質(zhì)體共轉染AAV-293 細胞,包裝成帶有CNTF 的重組腺相關病毒。收集病毒顆粒,同時以pAAV-LacZ 作為報告基因和pHelper、pAAV-RC 三種質(zhì)粒在和pAAV-CNTF 完全相同的條件下共轉染AAV-293 細胞,通過β—半乳糖苷酶染色測定轉染率,收集病毒原液。以不同稀釋梯度的病毒感染HT-1080 細胞,通過β—半乳糖苷酶染色測定病毒滴度。 結果:1.測序證實CNTF 與GeneBank 提供的原始序列完全一致。酶切鑒定與PCR篩選證實重組質(zhì)粒和預期結果完全一致。2.藉β—半乳糖苷酶原位染色法檢測報告基因LacZ 在人纖維肉瘤細胞(HT-1080)中的表達測得重組病毒滴度為7.0×10~7個"ml。 結論: 本實驗成功地克隆了CNTF 基因并構建了其腺相關病毒表達載體,為進一步研究用CNTF 基因轉染的方法來促進視神經(jīng)損傷修復奠定了基礎。
[Abstract]:Aim: to clone the rat ciliary nerve growth factor (CNTF) gene fragment and construct the adeno-associated virus expression vector by molecular biological technique, so as to study the effect of CNTF on rat retinal ganglion cells (RGCs). Methods: 1. The ORF (Open Reading frame) DNA fragment of rat CNTF was cloned by gene splicing. The DNA fragment was digested by Sal 鈪，

本文編號：2079876