本文選題：熱應(yīng)激 + 燙傷　； 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 熱應(yīng)激可由環(huán)境溫度過高(如燒傷、燙傷)或體內(nèi)的溫度增高(如發(fā)熱)所致,熱應(yīng)激可以激活多條細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進(jìn)應(yīng)激基因的快速表達(dá),以合成多種特異性和非特異性的對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用的應(yīng)激蛋白。小G蛋白R(shí)hoB是Rho亞家族的成員之一,國外近年來研究表明,RhoB是一個(gè)早期反應(yīng)基因,能夠被多種基因毒應(yīng)激原,如放射線、紫外線、抗癌藥(如5-氟脲嘧啶、順鉑)等誘導(dǎo)或使其激活。有報(bào)道RhoB上調(diào)能夠促進(jìn)細(xì)胞存活、抑制細(xì)胞凋亡。但是作為非基因毒應(yīng)激的熱應(yīng)激是否影響RhoB的表達(dá)未見報(bào)道。本課題從在體和離體兩個(gè)水平觀察了熱應(yīng)激對(duì)RhoB表達(dá)的影響,并進(jìn)一步研究了RhoB表達(dá)改變的機(jī)制以及可能的生物學(xué)意義,以期為臨床燒傷、燙傷等疾病的救治提供新的靶點(diǎn)。 一、燙傷和熱應(yīng)激能夠上調(diào)RhoB的表達(dá) 首先制備了30%體表面積III度燙傷大鼠模型,采用RT-PCR及Western blot方法檢測了肝和肺組織中RhoB mRNA及蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),大鼠肝,肺組織中RhoB mRNA在燙傷后2h時(shí)即上調(diào),4h時(shí)達(dá)到最大值,約為對(duì)照組的3～4倍(p0.01)。由于燙傷后體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一系列的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng),而我們以往的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)糖皮質(zhì)激素(GC)可以誘導(dǎo)RhoB的表達(dá)。為排除體內(nèi)的神經(jīng)內(nèi)分泌因素,確定熱應(yīng)激本身是否可直接上調(diào)RhoB,我們進(jìn)一步觀察了熱應(yīng)激對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞和人前列腺癌細(xì)胞系PC-3細(xì)胞中RhoB表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,熱應(yīng)激本身能以時(shí)間依賴性的方式快速地誘導(dǎo)這兩種體外培養(yǎng)細(xì)胞中RhoB mRNA和蛋白的表達(dá)。表明熱刺激在體內(nèi)和體外都可以上調(diào)RhoB的表達(dá),這種作用無明顯的組織細(xì)胞特異性。 二、熱應(yīng)激上調(diào)RhoB表達(dá)的機(jī)制研究 以RAW264.7細(xì)胞模型,我們對(duì)熱應(yīng)激上調(diào)RhoB表達(dá)的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。我們用放線菌素D抑制RAW264.7細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄,觀察了熱應(yīng)激對(duì)RhoB mRNA的穩(wěn)定性的影響,以明確熱應(yīng)激誘導(dǎo)RhoB表達(dá)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平,還是在轉(zhuǎn)錄后水平,結(jié)果顯示,在RAW264.7細(xì)胞中熱應(yīng)激能使RhoB的半衰期由3.98h增加至7.6h(p0.01),表明熱應(yīng)激RhoB mRNA的增加主要由RhoB的穩(wěn)定性增加所致。 已證實(shí)p38 MAPK信號(hào)通路能被包括熱應(yīng)激在內(nèi)的多種應(yīng)激原激活,我們因而觀察了p38 MAPK的抑制劑SB203580對(duì)熱應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞RhoB表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,于RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入SB203580抑制p38 MAPK的激活后,再將細(xì)胞進(jìn)行熱應(yīng)激處理,RhoB的誘導(dǎo)水平比沒經(jīng)SB203580處理細(xì)胞降低了約50%,表明p38 MAPK通路參與了熱應(yīng)激對(duì)RAW264.7細(xì)胞RhoB的誘導(dǎo)作用。 三、RhoB上調(diào)對(duì)SGK和HSP70表達(dá)的影響 血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶(serum and glucocorticoid-regulated protein kinase,SGK)是一個(gè)與PI-3K下游的PKB/AKT具有高度同源性的蛋白激酶,能被糖皮質(zhì)激素、血清以及多種應(yīng)激原所誘導(dǎo),在細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活和凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要的作用。本實(shí)驗(yàn)顯示,在RAW264.7細(xì)胞中,SGK也能被熱應(yīng)激所誘導(dǎo)。因此我們進(jìn)一步觀察了RhoB表達(dá)量的改變對(duì)SGK的影響,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染RhoB-wt質(zhì)粒使RhoB過表達(dá)的細(xì)胞熱應(yīng)激后,SGK mRNA的表達(dá)量比轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞明顯增高(約2.1倍,p0.01),相反通過轉(zhuǎn)染siRhoB質(zhì)粒抑制RhoB表達(dá)的細(xì)胞熱應(yīng)激后SGK mRNA的表達(dá)量明顯減少。表明在熱應(yīng)激后,RhoB的上調(diào)可能通過使SGK的表達(dá)增多,在熱應(yīng)激時(shí)起促進(jìn)細(xì)胞存活的作用。 熱應(yīng)激能夠誘導(dǎo)熱休克蛋白(HSPs)的表達(dá),HSP對(duì)于維持細(xì)胞生存、促進(jìn)細(xì)胞生存具有重要的作用。我們采用上述同樣的方法觀察了熱應(yīng)激前后RhoB表達(dá)量的改變對(duì)HSP70表達(dá)的影響,結(jié)果表明熱應(yīng)激時(shí)RhoB表達(dá)量的改變不影響HSP70 mRNA的表達(dá)。 綜上述,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),熱應(yīng)激能夠在整體水平和細(xì)胞水平誘導(dǎo)RhoB的表達(dá),這種誘導(dǎo)沒有明顯組織和細(xì)胞的特異性,熱應(yīng)激能夠明顯提高RhoB的穩(wěn)定性, p38 MAPK通路激活參與了RhoB表達(dá)的上調(diào)。RhoB的上調(diào)能夠促進(jìn)SGK的表達(dá),但不影響HSP70的表達(dá),這些都顯示出RhoB具有細(xì)胞應(yīng)激蛋白的特征。
[Abstract]:In recent years , it has been shown that RhoB is an early reaction gene which can be used to synthesize many kinds of specific and non - specific stress proteins , such as radiation , ultraviolet , anti - cancer drugs ( such as 5 - fluorouracil and cisplatin ) .






One , scald and heat stress can up - regulate the expression of RhoB






The expression of RhoB mRNA and protein in liver and lung tissues was detected by RT - PCR and Western blot .






Study on Mechanism of Up - regulation of RhoB Expression by Heat Stress






Using RAW264.7 cell model , we discussed the mechanism of up - regulation of RhoB expression by heat stress . The effect of heat stress on the stability of RhoB mRNA was observed by actinomycin D . The results showed that heat stress induced RhoB expression to increase from 3.98 h to 7.6 h ( p0.01 ) . The results showed that the increase of RhoB mRNA in RAW264.7 cells was mainly caused by the increase of RhoB .






It has been shown that p38 MAPK signal pathway can be activated by various types of stress including heat stress , and we have observed the effect of p38 MAPK inhibitor SB203580 on the expression of RhoB in heat stress induced cells . The results showed that the activation of p38 MAPK was inhibited by adding SB203580 to the culture solution of RAW264.7 cells . The induction of RhoB was reduced by about 50 % compared with that without SB203580 , suggesting that p38 MAPK pathway was involved in the induction of RAW264.7 cells RhoB .






The Effect of RhoB on the Expression of SGK and HSP70






Serum and glucocorticoid - regulated protein kinase ( SGK ) is a protein kinase with high homology with PKB / A downstream of PI - 3K . SGK plays an important role in the signal transduction of cell proliferation , cell survival and apoptosis .






Heat stress can induce the expression of heat shock protein ( HSPs ) , and HSP plays an important role in maintaining cell survival and promoting cell survival . The effect of the change of RhoB expression level before and after heat stress on the expression of HSP70 was observed by the same method . The results showed that the change of RhoB expression in heat stress did not affect the expression of HSP70 mRNA .






These results show that heat stress can induce RhoB expression at the whole level and cell level . This induction has no obvious tissue and cell specificity . Heat stress can obviously improve the stability of RhoB , and p38 MAPK pathway is involved in the up - regulation of RhoB expression . The up - regulation of RhoB can promote the expression of SGK , but it does not affect the expression of HSP70 , which show that RhoB has the characteristics of cell stress protein .
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：2058261