本文選題：手足口病 + 柯薩奇病毒A組型�。� 參考：《中國生物制品學雜志》2014年11期

【摘要】：目的應用Bac-to-Bac桿狀病毒系統(tǒng)表達柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A16,CVA16)病毒樣顆粒(virus-like particle,VLP),通過條件優(yōu)化,提高VLP的表達量,純化后檢測其免疫原性。方法對CVA16結構蛋白基因P1及蛋白酶基因3CD進行密碼子優(yōu)化,插入啟動子P10改造為CMV的重組桿狀病毒表達載體p Fast Bac Dual-CMV中,獲得重組穿梭質粒p Fast Bac Dual-CMV-P1-3CD,轉化DH10 Bac TM Competent Cells,提取重組桿粒Bacmid-CMVP1-3CD,轉染Sf9細胞,組裝成重組桿狀病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD,并進行擴增,采用間接免疫熒光法、Western blot法及透射電鏡觀察對表達產物進行初步鑒定。對重組CVA16 VLP的表達條件(病毒接種MOI值、感染時間及細胞培養(yǎng)方式)進行優(yōu)化后,通過20%蔗糖墊層及氯化銫連續(xù)密度梯度離心法純化CVA16VLP,并通過腹部皮下注射免疫ICR小鼠3次,采用間接ELISA法檢測小鼠血清特異性Ig G抗體滴度,微量中和試驗法檢測血清中和抗體滴度。結果重組桿狀病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD經PCR及測序鑒定證實組裝成功;重組CVA16 VLP在Sf9細胞中成功表達,優(yōu)化的表達條件為:重組桿狀病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD按MOI=5接種,Sf9細胞采用懸浮培養(yǎng)方式懸浮培養(yǎng)96 h,收集細胞及培養(yǎng)上清;純化的CVA16 VLP純度可達90%以上,針對VP2的單克隆抗體能與VP0及VP2發(fā)生特異性反應,電鏡下可見大量形態(tài)規(guī)則的類球形VLP,直徑約為27 nm;純化的CVA16 VLP免疫ICR小鼠后,誘導機體產生的特異性血清Ig G滴度可達1∶105,中和抗體滴度達1∶358。結論應用桿狀病毒表達系統(tǒng)成功表達了CVA16的P1和3CD蛋白,并組裝形成完整的VLP;通過質粒啟動子的改造及表達條件的優(yōu)化,有效提高了CVA16 VLP的表達量;純化的CVA16 VLP可誘導小鼠產生特異性體液免疫應答,為CVA16亞單位疫苗的研究提供了參考。
[Abstract]:Objective to express coxsackievirus A group 16 (Coxsackievirus A16) virus like particles like particle VLP by Bac-to-Bac baculovirus system, and to improve the expression of VLP by optimizing the conditions, and to detect its immunogenicity after purification. Methods the CVA16 structural protein gene P1 and protease gene 3CD were codon optimized and inserted into the recombinant baculovirus expression vector p Fast Bac Dual-CMV, which was transformed into CMV by promoter P10. The recombinant shuttle plasmid p Fast Bac Dual-CMV-P1-3 CD1 was obtained. The recombinant DH10 Bac TM Competent Cells, was transformed into Bacmid-CMVP1-3 CD. then transfected into Sf9 cells, the recombinant baculovirus Ac MNPV-CMV-P1-3 CD was assembled and amplified. The expression product was preliminarily identified by indirect immunofluorescence assay and transmission electron microscopy (TEM). After optimizing the expression conditions of recombinant CVA16 VLP (virus inoculation MOI value, infection time and cell culture mode), CVA16 VLP was purified by 20% sucrose cushion and cesium chloride continuous density gradient centrifugation, and ICR mice were immunized three times by abdominal subcutaneous injection. Indirect ELISA method was used to detect the titer of specific IgG antibody in serum of mice and the neutralization test was used to detect the titer of neutralized antibody in serum. Results the recombinant baculovirus ac MNPV-CMV-P1-3CD was successfully assembled by PCR and sequencing, and the recombinant CVA16 VLP was successfully expressed in Sf9 cells. The optimal expression conditions were as follows: the recombinant baculovirus ac MNPV-CMV-P1-3CD was inoculated with MOI=5 and cultured with Sf9 cells for 96 h, the cells were collected and supernatant was collected, and the purity of purified CVA16 VLP was more than 90%. Monoclonal antibodies against VP2 can react specifically with VP0 and VP2. A large number of regular spherical VLPs with a diameter of about 27 nm can be seen under electron microscope. The purified CVA16 VLP can be immunized with ICR mice. The titer of specific serum IgG and neutralizing antibody were 1: 105 and 1: 358 respectively. Conclusion the P1 and 3CD proteins of CVA16 were successfully expressed by baculovirus expression system, and the whole CVA16 VLP was assembled, and the expression level of CVA16 VLP was improved by the modification of plasmid promoter and the optimization of expression conditions. The purified CVA16 VLP can induce specific humoral immune response in mice and provide a reference for the study of CVA16 subunit vaccine.
【作者單位】： 首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院北京市兒科研究所 兒科學國家重點學科 教育部兒科重大疾病研究重點實驗室;中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所衛(wèi)生部醫(yī)學病毒和病毒病重點實驗室;
【基金】：(艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治科技重大專項)病毒性傳染病病原譜流行規(guī)律及變異研究(2013ZX10004202,2012ZX10004201-003)
【分類號】：R373.23;R392-33

【參考文獻】

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本文編號：1945967