本文選題：基因疫苗 + 免疫耐受　； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2007年博士論文

【摘要】： 類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是嚴重危害人類身體健康并影響勞動力的慢性全身性多發(fā)性、常見性自身免疫性疾病。國際上總患病人數約為6000萬-1.1億，我國總患病人數也逾400-600萬左右。僅就美國而言，僅2000年一年耗費在骨關節(jié)炎醫(yī)療、保健和勞資方面造成的經濟損失就高達14904億美元。針對國際社會RA發(fā)病率和致殘率日益增多的嚴峻形勢，WHO于2000年向全世界提出了“骨與關節(jié)10年”計劃，號召要“大力開展對骨關節(jié)病預防、診斷和治療的研究”以及“不斷開發(fā)和應用有改變病情效果并減少副作用的藥物”。因此，深入研究RA的發(fā)病機制、治療藥物及其治療方案就顯得尤為重要和迫切。鑒于RA病人的滑膜炎癥和關節(jié)破壞變形與免疫功能的改變密切相關，自上世紀九十年代以來國際上對RA新的免疫治療策略進行了廣泛深入探索。其中基因或DNA治療性疫苗就是最受關注和推崇的策略之一，也是近年來免疫學和臨床醫(yī)學界研究最活躍、最富有成效的領域之一。在短短不到十年的發(fā)展歷程中卻已取得了舉世注目的進展。目前國際上至少已有四個不同的基因治療性疫苗獲批進行臨床Ⅰ/Ⅱ實驗。然而，目前國際上探索用于RA研究的DNA疫苗僅限于T細胞疫苗或T細胞肽疫苗以及TCR疫苗，尚無針對特異性抗原的治療性疫苗。 業(yè)已證實，Ⅱ型膠原是人類RA最關鍵的自身抗原之一，在RA患者的血清及關節(jié)腔中均可發(fā)現(xiàn)大量的抗Ⅱ型膠原抗體和自身反應性T細胞。據此，我們在國際上首先原創(chuàng)性地提出研制基于雞Ⅱ膠原蛋白(CCII)耐受原表位能有效治療RA的新型DNA Tolerizing治療性疫苗的設想，我們前期的初步實驗結果表明了該思路的科學性和實踐的可行性。其堅實的理論基礎在于：1)．美國科學家首次發(fā)明“口服耐受”治療策略，并且采用CCII治療某些RA患者獲得肯定療效。該研究結果發(fā)表《Science》上，目前歐美發(fā)達國家整的進行口服耐受CCII治療RA的Ⅲ期臨床實驗研究；2)．歷經長期不懈努力，我們在國際上首次克隆成功編碼CCOL2A1全長基因，首先申報了中國發(fā)明專利，專利申請?zhí)枮椋?2149375.8；隨后又申報了國際PCT發(fā)明專利，專利申請?zhí)枮镻CT/CN03/0096，新近國際局作出“專利性國際初步報告”表明：支持PCT/CN03/00967所提出的1-10全部條款的新穎性、創(chuàng)造性和工業(yè)實用性的權利要求，并于2006年5月14日前進入美、英、德、法、日五國國家階段。由此為我們原創(chuàng)性研制成功能有效治療RA的新型基因Tolerizing治療性疫苗奠定了堅實的基礎和保障。本課題是將口服免疫耐受與基因治療性疫苗兩大策略充分進行有機結合以期創(chuàng)新性研制全新型DNA Tolerizing治療性疫苗，通過RA動物模型系統(tǒng)評價該疫苗的體內治療療效，并探索該疫苗療效的作用機制尤其是T細胞耐受機制。 勿庸置疑，本研究的關鍵是能否構建成功在真核細胞中高效表達的CCOL2A1基因疫苗。鑒于我們前期的工作已將CCOL2A1基因構建于原核表達載體中，為此，我們根據真核表達載體pcDNA3.1上的酶切位點EcoRⅠ和HindⅢ以及CCOL2A1全長cDNA上的信號肽序列設計引物，同時還在引物上添加了Kozak序列和信號肽序列，PCR擴增測序正確后連接到pcDNA3.1上，即獲得本實驗所需要的基因疫苗pcDNA3.1-CCOL2A1。為了檢證所構建的真核表達載體pcDNA3.1-CCOL2A1能否在體外有效地表達，我們將其轉染到COS-7細胞(10~6)中。經G418篩選后，培養(yǎng)陽性克隆，收獲、濃縮、真空干燥培養(yǎng)液，然后再溶解在0.1 mol／L的乙酸中。產物經15％SDS-PAGE電泳檢測，在143kD左右處可見一電泳條帶，經Western-Blot分析證明，在約143kD左右亦可見到特異性反應條帶，與質粒pcDNA3.1-CCOL2A1基因表達的CCII蛋白相對應。而僅轉染pcDNA3.1空載體的細胞培養(yǎng)液中則沒見特異性條帶出現(xiàn)。由此證明pcDNA3.1-CCOL2A1能在COS-7細胞中有效表達CCII多肽鏈的α亞單位，而且是分泌型表達。 我們知曉，膠原蛋白的表達是一個非常復雜的過程，涉及到翻譯后加工、糖基化、羥基化等多種步驟，至少需要8種酶的參與，其中脯氨酸羥化酶P4Hα、β兩個亞基的羥基化作用尤為重要，它能特異的使膠原三肽重復序列Gly-X-pro中的脯氮酸殘基羥基化。而羥化脯氨酸對于在生理條件下形成穩(wěn)定的膠原三螺旋結構是必需的，并且P4H的活性與膠原的合成呈平行關系，膠原表達量的提高有賴于P4H與其的共表達。為了驗證我們所構建的基因疫苗pcDNA3.1-CCOL2A1所表達的CCII是否是羥基化的氨基酸，我們采用MALDI-TOF-MS進行了相關分析。將SDS-PAGE中特異性條帶切割下來，，經過膠內酶切后進行肽質量指紋譜的鑒定，然后選取肽段進行ESI-MS/MS分析。串聯(lián)質譜圖經Micromass專用軟件MaxEnt3處理后，用Spectrum通過Mascot查淘NCBI、SWISSPROT等數據庫進行比對，結果證明該產物的確為alpha 1 typeⅡprocollagen[Gallus gallus]，即雞Ⅱ型膠原蚩白α鏈；其中脯氨酸(Pro)未被修飾，m/z為416.19。由此提示，基因疫苗pcDNA3.1-CCOL2A1所表達的CCII至少有部分沒有被羥基化，因為我們所挑選的肽段中的脯氨酸并沒有被羥基化。 那么，這種缺乏脯氨酸羥化酶P4Hα、β的pcDNA-CCOL2A1基因疫苗所表達的產物是否具有生物學功能?尤其是在RA大鼠體內能否誘導有效的免疫耐受?則是我們最為關注的大問題。因此我們采用天然CCII在Wistar大鼠中建立了標準的CIA大鼠RA模型。CIA的發(fā)病率高達73％(45/62)。經四肢關節(jié)腫脹程度評分、放射影象學和組織病理學驗證，該模型與文獻報道的一致，完全符合CIA大鼠RA模型體內實驗治療的標準要求。我們的體內實驗結果表明，空載體組和20μg/kg基因疫苗治療組對CIA大鼠四肢關節(jié)腫脹程度無任何治療作用；200μg/kg基因疫苗治療組可明顯減輕四肢關節(jié)腫脹程度，與其他所有組比較差異有統(tǒng)計學意義(*P＜0.05)，尤其是與目前臨床上用于治療RA病人的“金標準”治療MTX組的療效幾近相同；而400μg/kg高劑量基因疫苗組卻可使關節(jié)炎指數略有升高。隨后的組織病理學檢查及其評分結果顯示，注射200μg/kg pcDNA3.1對照組其后足有明顯的血管翳形成，滑膜增生和大量淋巴細胞浸潤，關節(jié)軟骨變薄且失去完整性，幾乎觀察不到完整的骨小梁，骨髓腔部為分布有大量破骨細胞；20μg／kg及400μg／kg治療組與關節(jié)炎對照組的結果相類似；而200μg/kg治療組和MTX治療組關節(jié)軟骨及其下的骨小梁結構與正常組接近，但關節(jié)滑膜亦有一定程度的增生。由此表明在所選擇的20μg/kg、200μg/kg、400μg／kg 3種基因疫苗治療劑量中，200μg/kg劑量組對CIA大鼠后足踝關節(jié)的炎癥以及軟骨和骨的破壞的抑制作用最為明顯，可使炎癥分數下降為對照組的50％(*P＜0.05)。對CIA大鼠后足踝關節(jié)X光放射學表現(xiàn)及評分結果進一步分析表明：在關節(jié)炎對照組可見軟組織腫脹，骨關節(jié)邊緣模糊，軟骨破壞；而在所選擇的三種治療劑量組中，只有200μ／kg治療組治療效果最明顯(*P＜0.05)，可使軟組織腫脹減輕，關節(jié)間隙清晰，MTX治療組效果與200μg／kg治療組治療效果接近：而20μg／kg和400μg／kg治療組的關節(jié)軟骨表面和骨密度與關節(jié)炎組比較變化不明顯；此外，20μg／kg治療組的放射學分數與空載體組類似，而400μg/kg治療組的放射學分數卻稍有升高。特別應該指出的是，200μg／kg基因疫苗組象MTX治療組一樣能顯著降低CIA大鼠血清中的抗CII抗體水平(P＜0.05)，而20μg／kg基因疫苗組與空載體組相比變化不大(P＞0.05)，但400μg／kg基因疫苗組卻顯著升高(P＜0.05)。因為業(yè)已證實，抗CII抗體水平反映了RA早期階段炎癥和骨質破壞的程度，被認為是揭示關節(jié)炎嚴重程度最可靠的指標。由此證明了pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗對CIA大鼠關節(jié)炎有顯著的治療作用，在缺乏外源脯氨酸羥化酶P4Hα、β的情況下并未影響pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗的體內治療效應。 為了探索pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗有效治療CIA大鼠的相關機制，我們較為系統(tǒng)的觀察了CIA大鼠注射pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗后4周脾細胞培養(yǎng)液中Th1和Th2因子如TGF-β1、TNF-α、IL-10、IL-4濃度的變化，CIA大鼠脾淋巴細胞特異性和非特異性增殖能力，CIA大鼠外周血中Th1／Th2細胞比例，CIA大鼠外周血中CD4~+CD25~+ Treg細胞占PBMC的比例以及大鼠外周血DC占PBMC的比例等指標。結果表明：200μg／kg基因疫苗組的TGF-β和IL-10水平明顯增高(P＜0.05)，TNF-α濃度顯著降低(P＜0.05)，而IL-4的濃度水平各組之間無明顯變化(P＞0.05)；20μg／kg和400μg／kg基因疫苗組以及空載體組間則無顯著變化(P＞0.05)。脾淋巴細胞增殖試驗結果顯示：200μg／kg基因疫苗組和MTX治療組的特異性脾淋巴細胞增殖能力明顯下降，與空載體組比較具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，400μg／kg基因疫苗組的脾淋巴細胞增殖能力較空載體組卻有升高現(xiàn)象，其余3組差別不明顯(P＞0.05)；當加入PHA進行非特異性刺激后，各治療組的淋巴細胞都發(fā)生非特異性增殖，各組之間差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。在檢測CIA大鼠外周血中Th1／Th2比例時發(fā)現(xiàn)，Th1:Th2的比率在正常組平均為0.06(范圍是0.03-0.09)，200μg／kg治療組為0.08(范圍是0.06-0.11)，MTX治療組為0.08(范圍是0.05-0.16)，它們都顯著比空載體對照組低(P＜0.05)，表明了一個顯著的Th1→Th2細胞的“shift”；而此比率在20μg／kg與400μg／kg治療組以及空載體對照組之間沒有明顯區(qū)別(P＞0.05)。鑒于CD4~+CD25~+Treg在參與免疫調控尤其是自身免疫反應的重要作用，我們還比較了正常組與各治療組以及空載體對照組中CD4~+淋巴細胞中CD4~+CD25~+Treg細胞所占的比例。結果發(fā)現(xiàn)：200μg／kg DcDNA3.1-CCOL2A1和MTX治療組中CD4~+CD25~+Treg細胞比例明顯高于對照組(P＜0.05)；20μg／kg pcDNA3.1-CCOL2A1治療組中的CD4~+CD25~+Treg細胞比例和對照組比幾乎沒有變化；而400μg／kg pcDNA3.1-CCOL2A1治療組CD4~+CD25~+Treg細胞比例雖然比對照組高，但沒有統(tǒng)計學意義。除此之外，我們又觀察了基因疫苗治療后CIA大鼠外周血DC占PBMC的比例，結果顯示，正常組中OX-62陽性細胞(DC)占外周血單個核細胞的比例為0.93±0.35％，CIA大鼠經pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗治療4周后而各個治療組中的OX-62陽性細胞占外周血單個核細胞的比例分別為1.48±0.70％，1.02±0.61％，1.18±0.31％，1.07±0.25％and 1.04±0.33％，200μg／kg pcDNA3.1-CCOL2A1治療組與其它治療組、正常組及對照組之間的差異有統(tǒng)計學意義，其余各個治療組與正常組及對照組之間的差異都沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。盡管目前我們還沒完全清晰pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗有效治療CIA大鼠的確切機制，但我們的上述結果高度提示，pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗可能通過增加機體內CD4~+CD25~+Treg，以降低T細胞對CII的特異性增殖反應，由此誘導了Th1→Th2細胞的“shift”，從而有效下調Th1-因子并上調了Th2因子。 總之，本研究在國際上原創(chuàng)性地研制成功了能有效治療RA大鼠模型的新型Tolerizing性基因治療性疫苗pcDNA3.1-CCOL2A1，并較系統(tǒng)深入地探索了其治療的相關機理，該系列研究結果已申報了中國發(fā)明專利，受理號為200610111396.2。為今后進一步利用DNATolerizing治療性疫苗策略治療RA奠定了堅實的基礎。從理論上講，這既能增強治療的特異性，又能克服一般免疫抑制劑以及非類固醇類抗炎藥或DMARDs的嚴重毒副作用，還不會導致耐藥性的產生。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R392;R593.22

【參考文獻】

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1 宋新強,奚永志;基因治療類風濕關節(jié)炎策略的研究進展[J];中華風濕病學雜志;2004年11期

2 宋新強;駱媛;王丹;劉曙光;劉金鋒;袁方;薛紅;劉楠;梁飛;孫玉英;奚永志;;雞Ⅱ型膠原基因疫苗pcDNA-CCOL2A1能有效治療大鼠類風濕性關節(jié)炎[J];中國科學C輯:生命科學;2006年06期

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4 宋新強;駱媛;王丹;劉曙光;劉金鋒;袁方;薛紅;劉楠;梁飛;孫玉英;奚永志;;新型雞Ⅱ型膠原基因疫苗治療膠原誘導的大鼠類風濕性關節(jié)炎的療效觀察[J];中華醫(yī)學雜志;2006年29期

本文編號：1862577