本文選題：漢坦病毒 + 系統(tǒng)發(fā)生樹��； 參考：《山東大學》2007年博士論文

【摘要】： 漢坦病毒(hantavirus，HV)屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)漢坦病毒屬。在臨床上引起腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)和漢坦病毒肺綜合征(hantavirus pulmonary syndrome，HPS)。漢坦病毒共有30多種基因型和血清型，但中國目前為止僅發(fā)現(xiàn)漢灘型(Hantaan，HTN)、漢城型(Seoul，SEO)和普馬拉型(Puumala，PUU)，均為HFRS的病原體。 HFRS臨床上以發(fā)熱、出血和腎損害為主要特征，它包括朝鮮出血熱、流行性出血熱和流行性腎病，每年在歐洲和亞洲有近10萬病例發(fā)生。較早的報道可追溯到蘇聯(lián)在1913和1932年，日本軍隊1932年在滿洲里，瑞典在1934年的暴發(fā)流行。自從1978年李鎬汪等從疫區(qū)的黑線姬鼠肺組織中分離到漢坦病毒76-118株以來，各國學者相繼分離到不同型別的漢坦病毒。引起HFRS的漢坦病毒包括HTN型、SEO型、多不拉伐—貝爾格萊德型(Dobrava，DOB)和PUU型，分別引起重度、中度和輕度的臨床癥狀。 1993年HPS首先在美國的四角地區(qū)暴發(fā)，臨床上早期出現(xiàn)發(fā)熱、寒戰(zhàn)等前驅癥狀，然后是突發(fā)性的呼吸困難，嚴重者導致死亡，病死率高，震驚了美國的公共衛(wèi)生官員和病毒學家。研究表明該病毒病原為SN型漢坦病毒，由鹿鼠攜帶，隨后又從不同地區(qū)的HPS病人體內分離到NY、BCC、BAY、AND等不同型別漢坦病毒。在我國尚未有HPS病例的報道。 各種鼠類是漢坦病毒重要的宿主和傳染源，他們各自攜帶不同的型別漢坦病毒。攜帶HTNV的黑線姬鼠主要在東亞和東歐，攜帶DOBV的黃頸喉姬鼠出現(xiàn)在南斯拉夫及鄰近地區(qū)，攜帶PUUV的歐洲棕背鼠存在于西北歐地區(qū)，而由褐家鼠攜帶的SEOV在世界范圍內廣泛存在。 漢坦病毒引起的HFRS在我國發(fā)病率高，是重點防治的傳染病之一。中國HFRS病人總數(shù)占世界發(fā)病人數(shù)的90％以上，每年新發(fā)病例數(shù)4～6萬。而山東省是HFRS的高發(fā)省份，年發(fā)病人數(shù)在我國常年位于前3位，2003年前則為全國第一位。山東省已發(fā)病例數(shù)占全國總病例數(shù)的1／3�？梢娚綎|省防治HFRS的工作具有極為重要的現(xiàn)實意義。山東引起HFRS的漢坦病毒以SEO型為主，也有HTN病毒存在，是混合疫區(qū)。對HFRS的診斷和防治歸根結底取決于對其病原學的研究進展，包括病毒分離、病毒基因及蛋白質的結構與功能的研究、分子流行病學、新型疫苗、新型診斷試劑的研究與開發(fā)等，其中對漢坦病毒的基因進行分析和分子流行病學研究又是最根本和最基礎的研究。而山東省分離全片段測序的病毒株太少，對它們的分子生物學性質尚缺乏深入研究。 漢坦病毒顆粒為圓形或卵圓形，外層是包膜，表面有突起，由G1和G2糖蛋白(glycoprotein，GP)組成。包膜內為病毒核酸、核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，NP)和RNA聚合酶組成的核衣殼，病毒體中核衣殼蛋白成分很高。病毒基因組為單股負鏈RNA，由長(L)、中(M)、短(S)三個節(jié)段組成，分別編碼依賴RNA的RNA多聚酶，G1和G2包膜糖蛋白和核衣殼蛋白。 G1、G2包膜糖蛋白對病毒的致病性起重要作用，包含了病毒的中和抗原位點、受體結合位點、融合肽和血凝位點。M片段中G1、G2的編碼順序為NH_2-G1-G2-COOH。M片段首先編碼產生一個126 kD的糖蛋白前體(glycoprotein precursor，GPC)，然后在翻譯的同時被細胞內的信號肽酶切割成G1、G2兩個蛋白，組成異二聚體表達在內膜系統(tǒng)，部分轉運至細胞膜表面，切割位點為一段絕對保守的WAASA的氨基酸序列。G1、G2共表達是二者在胞內有效轉運和行使功能的基礎。G1、G2富含半胱氨酸殘基，維持了異源二聚體在內膜系統(tǒng)管腔內高度有序的空間結構。G1、G2蛋白共有5～7個N—連糖基化位點，在二聚體蛋白的正確折疊中起一定作用。G1、G2蛋白N-端都有典型的信號肽序列，C-端為跨膜區(qū)和膜內區(qū)，但至今尚未能確定G1蛋白的C-端的真正構成，因為HV的G1蛋白C-端在胞內容易被蛋白酶降解，這也成為細胞中糖蛋白表達水平低的原因之一。病毒的糖蛋白在高爾基體膜表面累積成熟后，包裹由N蛋白和基因組RNA形成的核衣殼，在高爾基體膜上出芽，通過內膜系統(tǒng)的轉運釋放到胞外。M片段基因的變異速度是三個節(jié)段中最快的，是決定HV毒力的主要因素。 HV的核衣殼蛋白在感染的細胞中高度表達，形成大顆粒狀或絲狀的包涵體，在包裹病毒基因組RNA、組裝病毒顆粒中起重要作用。核衣殼蛋白的氨基酸序列較為保守，其免疫原性很強。其N-端的氨基酸主要是親水性的，具有高度的抗原保守性，幾乎所有的人類HV血清抗體都能識別此區(qū)；中間部分主要是親水性區(qū)域，在不同的HV中變異較大，含有RNA結合部位。C-端則較為保守。核蛋白刺激機體產生的抗體效價比G1、G2糖蛋白高。HFPS病人血清中抗核蛋白抗體出現(xiàn)最早，1周后，幾乎所有病人的抗核蛋白抗體均為陽性。因此，利用分子生物學技術，體外獲得核蛋白的工程蛋白，并在此基礎上建立新的血清學方法，是新型診斷試劑研究的熱點之一。 HV的膜融合方式為pH依賴型，即HV先以受體介導的內吞方式進入細胞后，在胞內體低pH值環(huán)境下，包膜糖蛋白G1、G2結構發(fā)生變化，暴露出內部融合肽，從而觸發(fā)融合。國內外學者先后證明了體外培養(yǎng)的不同類型的HV病毒株在酸性條件下都能引起Vero E6細胞的融合。HTN型HV致細胞融合作用的是包膜糖蛋白G1、G2，NP的共表達與否不會增減G1、G2的融合活性。在傳代細胞株中，僅有40代以內的Vero E6細胞可以在HV感染后或重組表達G1、G2后產生細胞融合現(xiàn)象，而BHK-21、Vero細胞和過度傳代(＞150)的Vero E6細胞則不會產生融合。目前尚沒有確定SEO型HV糖蛋白在細胞內的重組表達是否能夠引起細胞融合現(xiàn)象的產生。細胞融合作用是多種病毒增殖、擴散和致病過程中不可缺少的一步，因此對漢坦病毒膜融合的研究具有廣泛的意義。 本研究構建了漢坦病毒ZB8株M片段和JUN5-14株S片段的克隆載體，測定了基因序列，研究了山東分離的漢坦病毒毒株的遺傳和變異的分子水平特點；通過M和S片段對山東分離的漢坦病毒毒株進行系統(tǒng)發(fā)生樹分析，闡述漢坦病毒，尤其是山東株的分子流行病學特點，了解HV的變異規(guī)律，為進一步采取免疫和預防措施提供理論基礎；將NP基因在BHK21細胞上做瞬時表達，對其表達特點進行了研究，并觀察其做為底物檢測流行性出血熱病人血清中抗體的效果；構建了NP基因的酵母表達載體，并讓其在畢赤酵母中得到穩(wěn)定表達，檢測表達特點，為構建以重組NP為底物的血清學檢測試劑盒奠定基礎；構建糖蛋白基因的真核表達載體，并使糖蛋白基因在Vero E6細胞中表達，觀察其細胞融合現(xiàn)象，為糖蛋白結構和功能關系的研究、研制漢坦病毒基因工程亞單位疫苗奠定基礎。 一、山東株M和S片段的基因克隆和序列分析 本研究為避免病毒在細胞傳代引起的突變，直接從漢坦病毒感染鼠的鼠肺標本中，提取病毒RNA，根據SEO型HV的核苷酸序列及相關文獻，設計引物，利用RT-PCR的方法，擴增出ZB8株HV全M片段和JUN5-14株HV S片段的NP全編碼序列。并將PCR擴增片段連接T載體，并轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。酶切結果鑒定正確。測序后證實為SEO型HV序列。M和S片段的克隆，為研制新型診斷試劑，開發(fā)基因工程疫苗，以及結構蛋白的功能研究奠定了基礎。 我們對獲得的M和S片段序列特征進行了分析。ZB8株的M片段基因序列測定長度為3651bp，其中A堿基1107個，T堿基1097個，C堿基682個，G堿基765個，GC含量為39.6％。開放性閱讀框架(open reading frame，ORF)的位置位于47～3448 bp，編碼由1133個氨基酸組成的包膜糖蛋白前體。JUN5-14株的S片段編碼區(qū)基因序列測定長1290bp，其中A堿基403個，T堿基292個，C堿基257個，G堿基338個，GC含量為46.1％。編碼由429個氨基酸組成的NP。我們還利用TmPred和DNAStar等軟件預測了GP和NP的跨膜區(qū)、二級結構及其他蛋白質信息。 我們使用DNAStar軟件將測序結果與GenBank中國內外病毒株的相應序列進行了同源性分析。結果表明，JUN5-14株S片段的核苷酸序列與SEO型的各毒株的同源性在87.6～97.8％之間；ZB8株M片段的核苷酸序列與SEO型的各毒株的同源性在84.1～99.0％之間；M片段3′NCR的核苷酸序列是整個M片段中變異最頻繁的部位，而5′NCR的核苷酸序列是最為保守的。雖然JUN5-14和ZB8與SEO其他各株的核苷酸序列相比變異較大，但是其氨基酸序列高度保守，，同源性分別高達98.1～99.8％和96.9～99.6％之間。 系統(tǒng)發(fā)生樹分析表明：山東株JUN5-14和ZB8株均屬于SEO病毒第三亞型。與浙江分離株(Z37、ZT10、ZT71、Zy27)，北京分離株BiHD01，以及河北分離株93HBX12序列相近。其中在基于M片斷序列的發(fā)生樹上，ZB8株與山東GM04-38株親緣關系最近。序列分析研究探討了山東HV變異規(guī)律，為檢測和控制HV的流行提供了有力的分子水平的依據。 二、漢坦病毒JUN5-14株NP基因在BHK21細胞中的表達和重組NP的抗原性分析 本研究通過基因克隆的方法，以質粒pUCm-S為模板，應用PCR方法擴增出NP的全長基因，并在基因兩端創(chuàng)建相應的酶切位點，重組入質粒pBluscriptⅡSK~+載體的T7啟動子下游。酶切和測序鑒定正確，重組載體稱為pBSK-NP。 將重組載體轉染痘苗病毒vTF7-3預感染的BHK21細胞中，表達2～3天后，用間接免疫熒光實驗(indirect immunofluorescence assay，IFA)與SDS-PAGE和免疫印記觀察蛋白的表達情況。IFA結果顯示NP基因在BHK21細胞中得到了表達，在細胞中呈核周分布。SDS-PAGE和免疫印記也在48kD分子量處觀察到了陽性條帶。蛋白具有良好的免疫反應性，能與抗?jié)h坦病毒特異性抗體發(fā)應。 在IFA實驗中，我們用重組蛋白，檢測了17份HFRS病人血清和20份正常對照血清，結果顯示該法檢測血清抗體的敏感性為94.1％，特異性高達100％。證明了JUN5-14株NP是良好的診斷用靶抗原，為NP功能的研究，以及下一步NP基因的穩(wěn)定表達和診斷試劑盒的研制奠定了基礎。 三、漢坦病毒JUN5-14株NP基因在畢赤酵母表達系統(tǒng)中的表達和抗原性分析 以質粒pUCm-S為模板，應用PCR方法擴增NP的全長基因，并在基因兩端創(chuàng)建相應的酶切位點。NP基因與pGAPZαA載體均經雙酶切后連接，轉化大腸桿菌DH5α，經Zeocin篩選并測序，建立了表達載體pGAPZ-NP，并酶切、測序鑒定。結果顯示雙酶切出現(xiàn)相應長度的片段，測序證實NP基因無任何突變，插入了表達載體啟動子下游，并與上游信號肽序列和下游C-Myc和His6序列編碼框融合。 NP基因的表達質粒pGAPZ-NP經AvrⅡ線性化后用LiCl法轉化酵母菌，在YPD(含100μg／ml Zeocin)平板上兩次篩選，挑出單菌落，于液體YPD中培養(yǎng)，并在不同時點收集培養(yǎng)物，用SDS-PAGE和Western-blot進行分析。SDS-PAGE分析顯示NP基因在畢赤酵母中得到高效穩(wěn)定表達，在48h時表達量達到最高，之后趨于穩(wěn)定，上清和細胞中均有蛋白表達。Western-blot分析結果表明上清和細胞中的重組NP都能與抗HV的陽性血清反應。證明所表達的NP一部分在信號肽的引導下分泌出細胞外，并經過折疊形成了正確的構象。提示NP基因在酵母菌中成功表達，且免疫反應性良好，為血清學診斷的研制奠定基礎。 四、糖蛋白基因的瞬時表達 本研究采用PCR和基因克隆技術，將ZB8株G1、G2基因分別克隆到表達載體pCAGGS／MCS，酶切和測序鑒定正確后，將表達載體pCAGGS-G1、pCAGGS-G2共轉染Vero E6細胞，酸性MEM處理后觀察細胞融合現(xiàn)象的產生。并以IFA觀察糖蛋白的表達情況。 結果顯示在Vero E6細胞中成功表達出糖蛋白G1、G2，IFA顯示熒光信號分布在細胞漿中。二者的共表達可以產生良好的生物學活性，在酸性條件下引起Vero E6細胞發(fā)生融合，而轉染pCAGGS-NP的細胞沒有融合現(xiàn)象發(fā)生。共表達也未出現(xiàn)明顯的促進效應。本研究首次從基因水平證實了SEO型HV產生細胞融合現(xiàn)象的結構存在于糖蛋白G1和G2中，為糖蛋白結構與功能研究，制備有效的亞單位疫苗奠定了科學基礎。 從本實驗結果可得出結論： 本實驗成功構建了含有漢坦病毒ZB8株全M片段核苷酸序列的克隆以及JUN5-14株全S片段編碼區(qū)的克隆。兩株病毒均是SEO型漢坦病毒，為第三亞型。表達載體pBSK-NP能在感染痘苗病毒vTF7-3預感染的BHK21細胞內有效地表達出NP，蛋白具有良好的免疫反應性，在IFA實驗中用來檢測血清抗體的敏感性和特異性均比較高，是良好的診斷用靶抗原。成功構建了含有HV NP全基因的酵母表達載體，所表達的蛋白免疫反應性良好。在Vero E6細胞中成功表達出糖蛋白G1、G2，二者的共表達可以產生良好的生物學活性，在酸性條件下引起Vero E6細胞發(fā)生融合。本課題為闡明SEO型HV的遺傳和變異規(guī)律，檢測和控制HV的流行提供了有力的分子水平的依據，為進一步研究開發(fā)新型HV診斷試劑創(chuàng)造了有利條件，并且為進一步研究GP的結構與功能，制備有效的亞單位疫苗奠定了堅實基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R373

【參考文獻】

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本文編號：1842675