本文選題：高遷移率族蛋白B1 + 樹突狀細(xì)胞��； 參考：《中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院》2007年碩士論文

【摘要】： 目的：高遷移率族蛋白B1(HMGB1)作為一種晚期炎癥介質(zhì)，介導(dǎo)了膿毒癥和其他系統(tǒng)性炎癥的致死性效應(yīng)，研究其病理生理作用將有助于深化對膿毒癥發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，并為免疫反應(yīng)的調(diào)控提供潛在的干預(yù)目標(biāo)。本試驗(yàn)擬應(yīng)用HMGB1體外刺激大鼠脾臟樹突狀細(xì)胞(DC)，，闡明HMGB1對DC免疫功能的影響并對其機(jī)制進(jìn)行初步探討，旨在為膿毒癥及多器官功能障礙綜合征的預(yù)防和治療提供新思路。 方法：分離正常Wistar大鼠脾臟DC，在含10％小牛血清的1640培養(yǎng)液中調(diào)整細(xì)胞濃度1×10~6/孔后置于24孔培養(yǎng)板。實(shí)驗(yàn)一：采用HMGB1刺激，觀察HMGB1刺激與DC表面共刺激分子CD80、CD86和主要組織相容性復(fù)合物(MHC)Ⅱ表達(dá)、細(xì)胞因子白介素(IL)-12、腫瘤壞死因子(TNF)-α基因表達(dá)和蛋白合成的時間-效應(yīng)關(guān)系及劑量-效應(yīng)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)二：HMGB1刺激后，采用激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測DC表面晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)的表達(dá)強(qiáng)度。同時觀察抗RAGE抗體對HMGB1刺激后DC表面共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)三：采用1μg/ml的HMGB1刺激48小時(h)，DC與脾T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞比例分別為1：50、1：100、1：150、1：200混合，于共同作用后3天、5天觀察T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、功能性極化、IL-2、白介素-2受體(IL-2R)基因/蛋白表達(dá)及核因子(NF)-κB活性的情況。 結(jié)果：1．HMGB1對大鼠脾臟DC成熟分化的影響及機(jī)制：(1)與正常對照組相比，HMGB1作用后DC表面共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ表達(dá)分別于24～72h明顯上調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)，其中以作用48h后DC表面共刺激分子表達(dá)上調(diào)尤為顯著(P＜0.01)；0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml的HMGB1刺激均可誘導(dǎo)DC表面共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05或P＜0.01)，其中HMGB1的濃度在1μg/ml時大鼠DC表面共刺激分子表達(dá)增強(qiáng)最明顯(P＜0.01)。(2)HMGB1刺激后，DC IL-12、TNF-α基因表達(dá)和蛋白合成分別于24～72h明顯上調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)，其中以作用48h后其表達(dá)上調(diào)尤為顯著(P＜0.01)；0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml的HMGB1刺激均可誘導(dǎo)DC IL-12、TNF-α基因表達(dá)和蛋白合成增強(qiáng)(P＜0.01)，其中HMGB1的濃度在1μg/ml時，DC IL-12、TNF-α基因/蛋白表達(dá)水平最高(P＜0.01)。2．HMGB1介導(dǎo)大鼠脾臟DC作用的受體機(jī)制：1μg/ml HMGB1刺激48h后，DC表面受體RAGE表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.01)；1：50、1：100、1：200稀釋度的抗RAGE多克隆抗體處理均可使HMGB1誘導(dǎo)DC表面共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ表達(dá)減弱(P＜0.01)，其中抗RAGE多克隆抗體的稀釋度在1：100時，大鼠DC表面共刺激分子表達(dá)減弱最明顯(P＜0.01)。3．HMGB1誘導(dǎo)的DC對大鼠脾T淋巴細(xì)胞功能的影響：(1)DC與T淋巴細(xì)胞以1：50、1：100、1：150、1：200的比例相互作用，脾T淋巴細(xì)胞對絲裂原刺激的增殖反應(yīng)均明顯增強(qiáng)、上清液中干擾素(IFN)-γ含量顯著升高和IL-4含量明顯降低(P＜0.01)，其中細(xì)胞比例1：150組最為明顯。脾T淋巴細(xì)胞對絲裂原刺激的增殖反應(yīng)增強(qiáng)、IFN-γ含量增加和IL-4含量降低均以第3天最為顯著。(2)實(shí)驗(yàn)研究顯示，DC與T淋巴細(xì)胞以1：50、1：100、1：150、1：200的比例相互作用，脾T淋巴細(xì)胞IL-2、IL-2R基因/蛋白表達(dá)及NF-κB活性明顯增強(qiáng)(P＜0.01)，其中細(xì)胞比例1：150組尤為明顯。脾T淋巴細(xì)胞IL-2、IL-2R基因/蛋白表達(dá)及NF-κB活性均以第3天最為顯著。 結(jié)論：1．HMGB1能誘導(dǎo)DC表面共刺激分子表達(dá)增強(qiáng)和IL-12、TNF-α的合成、釋放，HMGB1可能是誘導(dǎo)DC成熟的重要免疫刺激信號。2．HMGB1能上調(diào)DC受體RAGE表達(dá)，RAGE可能是參與HMGB1誘導(dǎo)DC成熟分化的主要受體之一。3．HMGB1誘導(dǎo)的DC使脾T淋巴細(xì)胞對絲裂原刺激的增殖反應(yīng)明顯增強(qiáng)，并促進(jìn)T淋巴細(xì)胞向Th1功能性極化。4．初步明確了HMGB1誘導(dǎo)的DC影響脾T淋巴細(xì)胞IL-2生成和IL-2R表達(dá)的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
[Abstract]:Objective: high mobility group protein B1 (HMGB1), as a late inflammatory mediator, mediates the lethal effects of sepsis and other systemic inflammation. The study of its pathophysiological role will help to deepen the understanding of the pathogenesis of sepsis and provide potential intervention targets for the regulation of immune responses. This test is intended to be applied to HMGB1 in vitro spines. The rat splenic dendritic cells (DC) were stimulated to elucidate the effect of HMGB1 on the immune function of DC and to explore its mechanism. The aim is to provide new ideas for the prevention and treatment of sepsis and multiple organ dysfunction syndrome.
Methods: the spleen DC of normal Wistar rats was isolated, and the cell concentration was adjusted in the 1640 culture solution containing 10% calf serum. The cell concentration was adjusted to the 24 hole culture plate. Experiment 1: HMGB1 stimulation was used to observe the expression of CD80, CD86 and the major histocompatibility complex (MHC) II (MHC) II of the HMGB1 stimulation and the DC surface, and the cytokine interleukins (IL) -12, swelling. The time effect relationship and dose effect relationship of tumor necrosis factor (TNF) - alpha gene expression and protein synthesis. Experiment two: HMGB1 stimulation, using laser scanning confocal microscope and flow cytometry to detect the expression intensity of advanced glycosylated end product receptor (RAGE) on the surface of DC. Meanwhile, the anti RAGE antibody was observed on the DC surface after HMGB1 stimulation. The influence of the expression of CD80, CD86 and MHC II. Experiment three: the HMGB1 stimulation of 1 g/ml was 48 hours (H), the proportion of DC to spleen T lymphocyte was 1:50,1:100,1:150,1:200 mixed, 3 days after the joint action, and 5 days to observe the proliferation reaction of T lymphocyte, functional polarization, IL-2, interleukin--2 receptor gene / protein table And the activity of nuclear factor (NF) - kappa B.
Results: the effect and mechanism of 1.HMGB1 on the maturation and differentiation of DC in spleen of rats: (1) compared with the normal control group, the expression of CD80, CD86 and MHC II on the DC surface was up significantly up (P < 0.05 or P < 0.01) after HMGB1 action, especially after the action 48h, the expression of the expression of CO stimulants on the DC surface was particularly significant (0.01); 0.1 mu, The HMGB1 stimulation of 1 mu g/ml and 10 mu g/ml could induce the expression of CD80, CD86 and MHC II (P < 0.05 or P < 0.01) on the surface of DC (P < 0.05 or P < 0.01). The expression of CO stimulatory molecules on the DC surface was the most obvious (2) when the concentration of HMGB1 was 1 mu g/ml. The regulation (P < 0.05 or P < 0.01) was especially significant after the action of 48h (P < 0.01); HMGB1 stimulation of 0.1 mu g/ml, 1 mu g/ml and 10 mu g/ml could induce DC IL-12, TNF- alpha gene expression and protein synthesis enhanced (P < 0.01). The receptor mechanism of spleen DC action in rats was mediated: after 1 mu g/ml HMGB1 stimulated 48h, the expression of DC surface receptor RAGE was significantly up-regulated (P < 0.01), and the anti RAGE polyclonal antibody treatment of 1:50,1:100,1:200 dilution can induce HMGB1 to induce DC surface CO stimulation of molecular CD80. At 1:100, the expression of CO stimulatory molecules on DC surface weakened the most obvious (P < 0.01).3.HMGB1 induced DC on the function of T lymphocyte in the spleen of rats: (1) the interaction between DC and T lymphocytes was proportional to the proportion of 1:50,1:100,1:150,1:200, and the proliferation of mitogen stimulated by the spleen T lymphocyte was obviously enhanced, and the supernatant was in the supernatant. The content of interferon (IFN) - gamma was significantly increased and the content of IL-4 decreased significantly (P < 0.01). The proportion of cell ratio in 1:150 group was the most obvious. The proliferation response of splenic T lymphocytes to mitogen stimulated proliferation, the increase of IFN- gamma content and the decrease of IL-4 content were the most significant. (2) the experimental study showed that DC and T lymphocyte were 1:50,1:100,1:150,1. 200 ratio interaction, the IL-2 of spleen T lymphocyte, IL-2R gene / protein expression and NF- kappa B activity were obviously enhanced (P < 0.01), in which the proportion of cells in 1:150 group was particularly obvious. The IL-2 of spleen T lymphocyte, IL-2R gene / protein expression and NF- kappa B activity were the most significant in third days.
Conclusion: 1.HMGB1 can induce the enhancement of the expression of CO stimulatory molecules on the surface of DC and the synthesis and release of IL-12, TNF- alpha, and HMGB1 may be an important stimulant signal to induce the maturation of DC..2.HMGB1 can up regulate the RAGE expression of DC receptor. RAGE may be a major receptor involved in HMGB1 inducible DC mature differentiation. The proliferative response of the spur stimulation was obviously enhanced, and the T lymphocyte was promoted to Th1 functional polarization.4. to clarify that HMGB1 induced DC affects the related signal transduction pathway of IL-2 generation and IL-2R expression in spleen T lymphocyte.

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392;R631.2

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