本文選題：HSPC238 + 酵母雙雜交　； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：研究背景和目的原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellular caicinoma,HCC；簡稱肝癌)是臨床上常見的惡性腫瘤,近年來隨著乙型和丙型肝炎病毒的感染率在世界范圍內(nèi)的增加,肝癌的發(fā)病率也逐漸上升,有報告顯示,每年有新發(fā)肝癌超過70萬例。目前肝癌已成為世界上第五大最常見的惡性腫瘤,肝癌致死率在癌癥死亡率中排名第三。只有約15%的肝癌有機(jī)會通過手術(shù)治愈(例如,肝切除或移植)或微創(chuàng)局部治療(例如,射頻消融)。隨著醫(yī)學(xué)影像等技術(shù)手段的提高,肝癌的早期診斷和治療雖取得了巨大進(jìn)步,但長期預(yù)后仍不理想,有學(xué)者研究報道,肝癌患者平均的5年生存率僅為8.9%。大多數(shù)肝癌是由慢性肝病(如乙肝、丙肝、酒精肝等)發(fā)展而來的,但仍有15-50%的新發(fā)病例病因不清。肝癌的早期轉(zhuǎn)移是影響其臨床預(yù)后的一個重要因素,在這一復(fù)雜過程中,涉及到多基因、多蛋白的參與。當(dāng)前對腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究大多關(guān)注癌基因、抑癌基因、小分子RNA等單個或多個分子的作用和功能,而蛋白質(zhì)作為基因編碼產(chǎn)物,是生命活動的最終執(zhí)行者,其在腫瘤中的表達(dá)、對腫瘤發(fā)生發(fā)展所起的作用,仍有待闡明。隨著分子生物學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展,在細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)又重新得到重視,蛋白質(zhì)分子間的相互作用作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要內(nèi)容之一已成為近年來的研究熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)之間的相互作用不但能夠提供蛋白質(zhì)本身功能的信息,而且能夠提供蛋白質(zhì)在代謝調(diào)控、信號傳導(dǎo)和復(fù)合體中起作用的信息,這為揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制帶來了新的希望。鋅指蛋白具有指狀結(jié)構(gòu),常出現(xiàn)在DNA結(jié)合蛋白中,屬于真核轉(zhuǎn)錄因子的一大家族,鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域有胱氨酸和組氨酸殘基以及鋅離子構(gòu)成。根據(jù)鋅離子與這兩種氨基酸的組合方式,鋅指蛋白可以分為C2H2、C3、C4等多種類型。許多鋅指蛋白除了能夠識別特定的DNA序列,還參與蛋白質(zhì)與RNA和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。本研究中的HSPC238蛋白,其基因組全長716個堿基,編碼153個氨基酸,其第40至60氨基酸殘基能夠形成特殊的RING指結(jié)構(gòu)域,故也是一種C3HC4型鋅指蛋白。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)HSPC238蛋白是一種新的抑癌蛋白。我們通過對139例具有完整臨床隨訪資料的肝癌組織標(biāo)本進(jìn)行了免疫組織化學(xué)檢測,結(jié)果顯示：HSPC238蛋白在正常肝組織中的表達(dá)水平顯著高于肝癌組織,與肝癌患者的年齡、性別及臨床分期無相關(guān)性,但與肝癌的分化程度呈負(fù)相關(guān)；在體外培養(yǎng)的SMMC7721細(xì)胞系中改變HSPC238的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),上調(diào)HSPC238的表達(dá)可抑制SMMC7721細(xì)胞株的增殖和克隆形成,下調(diào)HSPC238的表達(dá)可促進(jìn)SMMC7721細(xì)胞株的增殖和克隆形成；進(jìn)一步通過體內(nèi)裸鼠成瘤實驗證實,上調(diào)HSPC238可抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖,干擾HSPC238的表達(dá)則可促進(jìn)裸鼠體內(nèi)腫瘤的增殖；進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn),HSPC238通過ERK/MAPK途徑對肝癌細(xì)胞發(fā)揮抑制作用。這些前期研究結(jié)果為探索肝癌抑癌機(jī)制及尋找新的肝癌診斷潛在標(biāo)志物提供了新的理論依據(jù)和研究靶點(diǎn)。除上述研究結(jié)果外,國內(nèi)外尚無對HSPC238蛋白與肝癌功能的相關(guān)報道,為進(jìn)一步深入研究HSPC238在肝癌中的抑癌作用機(jī)制,本實驗擬通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與HSPC238相互作用的目標(biāo)蛋白,并進(jìn)一步通過激光共聚焦、免疫共沉淀及pull-down等實驗技術(shù)對篩選到的目標(biāo)蛋白進(jìn)行驗證,從而為全面研究HSPC238的功能及其在肝癌中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法：1.重組誘餌質(zhì)粒載體的構(gòu)建、酵母轉(zhuǎn)化及自激活檢測1.1重組誘餌質(zhì)粒載體的構(gòu)建將裝載了人工合成的目的基因HSPC238的質(zhì)粒載體(pUC19-HSPC238質(zhì)粒,前期研究中制備并保存)通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和質(zhì)粒抽提,以獲取足量的目的基因片段；所得質(zhì)粒(pUC19-HSPC238質(zhì)粒)經(jīng)電泳、測序等方法鑒定后與酵母雙雜交誘餌載體質(zhì)粒pGBKT7雙酶切后連接,初步獲得含誘餌蛋白(HSPC238)的重組載體pGBKT7-HSPC238,連接體系再次轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10以擴(kuò)增重組載體(pGBKT7-HSPC238),隨機(jī)挑取3個轉(zhuǎn)化子接種于帶卡那抗性的液體LB培養(yǎng)基過夜,抽提質(zhì)粒并電泳初步鑒定質(zhì)粒,酶切進(jìn)一步鑒定是否插入了目標(biāo)片段(HSPC238)。1.2誘餌載體的酵母轉(zhuǎn)化及自激活檢測經(jīng)過鑒定的pGBKT7-HSPC238載體與pGADT7空載體采用醋酸鋰法共轉(zhuǎn)化酵母AH109細(xì)胞,同時根據(jù)試劑盒說明書中的要求設(shè)置陽性及陰性對照,分別涂布不同營養(yǎng)缺陷性平板,通過藍(lán)白斑篩選及營養(yǎng)缺陷篩選,判斷誘餌蛋白HSPC238對酵母AH109是否存在毒性及自激活活性。2.人胎肝cDNA文庫的篩選2.1文庫質(zhì)粒的擴(kuò)增、抽提和轉(zhuǎn)化篩選稀釋文庫菌液后涂布LB+Amp平板擴(kuò)增培養(yǎng),抽提文庫質(zhì)粒,檢測所得文庫質(zhì)粒的濃度及質(zhì)量。用含有正確pGBKT7-HSPC238載體的感受態(tài)酵母菌AH109作為受體菌,將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)入其中,觀察轉(zhuǎn)化結(jié)果。2.2陽性克隆的鑒定和質(zhì)粒抽提用絨布對篩庫平板(SD-Trp-Leu-His平板)進(jìn)行影印清除,以消除背景生長菌落的影響,挑取再次長出的轉(zhuǎn)化子依次經(jīng)SD-Trp-Leu-His+3AT平板、SD-Trp-Leu-His-Ade平板及藍(lán)白斑篩選,將能同時通過3個報告基因(LacZ,HIS3和ADE2)檢測的陽性克隆菌株接種于SD-Leu液體培養(yǎng)基,振蕩培養(yǎng)過夜后抽提酵母質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng),轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接含有Amp的LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒。2.3陽性克隆質(zhì)粒的BLAST比對分析及回轉(zhuǎn)驗證對質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序和BLAST比對,結(jié)合生物信息學(xué)分析,確定陽性克隆菌落所含目標(biāo)蛋白的基因名。將抽提到的陽性克隆質(zhì)粒分別與誘餌基因質(zhì)粒(pGBKT7-HSPC238)共轉(zhuǎn)化同一個酵母細(xì)胞,再次檢驗每一對蛋白在共轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞中對3個報告基因(LacZ, HIS3和ADE2)的激活情況。對其中重復(fù)出現(xiàn)的陽性克隆只選取其中ORF (Open Reading Frame,開放閱讀框)序列最長的一個。最后根據(jù)文獻(xiàn)分析,初步鎖定五種可能與HSPC238相互作用的目標(biāo)蛋白用于后續(xù)研究。3. HSPC238與目標(biāo)蛋白相互作用的鑒定3.1激光共聚焦定位檢測構(gòu)建HSPC238、目標(biāo)蛋白的過表達(dá)質(zhì)粒,其中HSPC238蛋白攜帶Flag標(biāo)簽(pcDNA3.1-HSPC238-Flag),目標(biāo)蛋白攜帶His標(biāo)簽(pcDNA3.1-目標(biāo)蛋白-His)。分別將pcDNA3.1-HSPC238-Flag質(zhì)粒與pcDNA3.1-目標(biāo)蛋白-His質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染293T和SMMC7721細(xì)胞,依次加入一抗(兔源性anti-HSPC238、鼠源性anti-目標(biāo)蛋白)、二抗(CY3標(biāo)記的羊抗兔二抗、FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗)后孵育,通過激光共聚焦顯微鏡觀察HSPC238及目標(biāo)蛋白在293T和SMMC7721細(xì)胞中的共定位情況,以確定目標(biāo)蛋白與HSPC238蛋白是否在細(xì)胞內(nèi)存在空間相遇的可能。3.2免疫共沉淀分析HSPC238與目標(biāo)蛋白是否在體內(nèi)存在相互作用以HSPC238過表達(dá)質(zhì)粒(pcDN A3.1-HSPC238-Flag)和目標(biāo)蛋白過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-目標(biāo)蛋白-His)分別共轉(zhuǎn)染293T、SMMC7721細(xì)胞株,裂解細(xì)胞后收集蛋白上清,以anti-Flag抗體進(jìn)行免疫共沉淀以獲取共沉淀物,再分別以anti-His、anti-Flag、anti-HSPC238、anti-目標(biāo)蛋白做免疫印跡,同時與細(xì)胞裂解液比較,以確定HSPC28和目標(biāo)蛋白是否存在相互作用。3.3 Pull-Down分析HSPC238與目標(biāo)蛋白是否在體內(nèi)存在相互作用以HSPC238過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-HSPC238-Flag)和目標(biāo)蛋白過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-目標(biāo)蛋白-His)分別共轉(zhuǎn)染293T、SMMC7721細(xì)胞株,裂解細(xì)胞后,收集蛋白上清,鎳柱純化攜帶His標(biāo)簽的目的蛋白,BCA法測定洗脫液濃度,選取濃度最高的一組點(diǎn)樣,以anti-Flag、anti-HSPC238、anti-His、anti-目標(biāo)蛋白等抗體做免疫印跡,同時與細(xì)胞裂解液比較,以確定HSPC238和目標(biāo)蛋白是否存在相互作用。結(jié)果：1.重組誘餌質(zhì)粒載體的構(gòu)建、酵母轉(zhuǎn)化及自激活檢測擴(kuò)增后的pUC19-HSPC238質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒pGBKT7雙酶切后,在T4連接酶的作用下成功連接,連接體系轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒電泳并測序表明：包括sfiI酶切位點(diǎn)在內(nèi)的序列均未發(fā)生突變,重組質(zhì)粒pGBKT7-HSPC238構(gòu)建成功；進(jìn)一步轉(zhuǎn)化酵母AH109細(xì)胞,經(jīng)通過藍(lán)白斑篩選及營養(yǎng)缺陷篩選,三種報告基因(LacZ, HIS3和ADE2)均未激活,即誘餌蛋白HSPC238對酵母AH109不存在毒副作用及自激活活性。2.人胎肝cDNA文庫的篩選文庫菌經(jīng)稀釋后擴(kuò)增并抽提質(zhì)粒,最終得到的文庫質(zhì)粒濃度為600ng/ul。涂布LB+Amp抗性平板,隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,所得文庫質(zhì)粒均插入了不同條帶的目的基因,即文庫質(zhì)量合格。將此文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含有正確pGBKT7-HSPC238載體的酵母菌AH109,用絨布對篩庫平板(SD-Trp-Leu-His)進(jìn)行影印清除后,繼續(xù)培養(yǎng)兩周,初步得到124個轉(zhuǎn)化子菌落。轉(zhuǎn)接SD-Trp-Leu-His+3AT平板,排除11個由于AH109菌株中his3基因滲漏表達(dá)所造成的假陽性菌落。再次轉(zhuǎn)接SD-Trp-Leu-His-Ade平板,排除7個不能激活HIS3和ADE2報告基因的假陽性菌落。最后檢測LacZ報告基因,通過藍(lán)白斑篩選,再次排除掉不能變藍(lán)的42個假陽性菌落,最終得到64個可能存在與人HSPC238相互作用蛋白的可疑菌落。將同時通過了3個報告基因(LacZ, HIS3和ADE2)檢測的64個可疑陽性克隆菌株轉(zhuǎn)接SD-Leu液體培養(yǎng)基,擴(kuò)增培養(yǎng)后抽提酵母質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10進(jìn)行擴(kuò)增,轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接含有Amp的LB液體培養(yǎng)擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒,對質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序和BLAST比對結(jié)合生物信息學(xué)分析,表明它們分別編碼19種不同的蛋白質(zhì)。且編碼該19種蛋白的陽性菌落均通過回轉(zhuǎn)驗證,最后經(jīng)查閱文獻(xiàn),我們選定最有可能與HSPC238相互作用的五種蛋白(HMOX1, MT2A, RPS27A, UBB, RPL5)用于后續(xù)研究。3. HSPC238相互作用蛋白的鑒定激光共聚焦技術(shù)觀察顯示,HSPC238蛋白與目標(biāo)蛋白(HMOX1, MT2A, RPS27A, UBB, RPL5)在293T和SMMC7721細(xì)胞中都分布于細(xì)胞質(zhì)中,在胞質(zhì)中高度共存,即有在胞質(zhì)中存在相互作用的可能。免疫共沉淀前期實驗中,pCDNA3.1-RPL5-His質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,以anti-His嘗試多次仍無法檢測到RPL5蛋白的表達(dá),故排除RPL5蛋白,后續(xù)實驗僅以HMOX1, MT2A, RPS27A, UBB作為研究對象。免疫共沉淀實驗結(jié)果表明,共轉(zhuǎn)染組裂解細(xì)胞收集的蛋白上清液,經(jīng)anti-Flag抗體獲取共沉淀物后,經(jīng)anti-His、anti-Flag、anti-HSPC238、anti-目標(biāo)蛋白(HMOX1, RPS27A, UBB, MT2A)等抗體做免疫印跡,均能檢測到正確大小的目的條帶,且與細(xì)胞裂解液中的表達(dá)位置基本一致,由此,我們推測HSPC238與HMOX1, RPS27A, UBB, MT2A等目標(biāo)蛋白在293T和SMMC7721細(xì)胞株內(nèi)發(fā)生了結(jié)合。Pull-Down實驗表明,共轉(zhuǎn)染組裂解細(xì)胞收集的蛋白上清液,經(jīng)鎳柱純化攜帶His標(biāo)簽的蛋白復(fù)合物,洗脫后選取洗脫液濃度最高的一組點(diǎn)樣,以anti-Flag、 anti-HSPC238、anti-His、anti-目標(biāo)蛋白(HMOX1, RPS27A, UBB, MT2A)等抗體做免疫印跡,結(jié)果顯示洗脫液中能檢測到預(yù)期的目的條帶,且與裂解液組的泳帶位置基本一致,由此我們推測HSPC238與HMOX1, RPS27A, UBB, MT2A存在相互作用。結(jié)論：本實驗成功構(gòu)建了HSPC238真核表達(dá)載體,通過酵母雙雜交技術(shù)從胎肝cDNA文庫中篩選到與HSPC238相互作用的目標(biāo)蛋白,經(jīng)文獻(xiàn)分析初步鎖定幾種特定蛋白后,通過激光共聚焦、免疫共沉淀及Pull-Down實驗證實了HSPC238與目標(biāo)蛋白在細(xì)胞體內(nèi)存在相互作用。本實驗為進(jìn)一步研究HSPC238的功能及在肝癌中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R3411

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