表達人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4的非復制型腺病毒的構建與鑒定
發(fā)布時間:2018-04-26 23:26
本文選題:骨形態(tài)發(fā)生蛋白 + 非復制型腺病毒; 參考:《安徽醫(yī)科大學》2006年碩士論文
【摘要】:目的 構建含有人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4基因的非復制型腺病毒表達載體(?)AdE/hBMP-4并檢測目的基因的表達,以期用于骨組織工程基因治療的研究。 方法 EcoR Ⅰ雙酶切質粒pCS2(+)/hBMP-4獲得目的基因片段,將hBMP-4基因片段首先克隆至非病毒真核表達載體pcDNA3.1(+),后利用該載體上含有的酶切位點Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ,再將hBMP-4基因片段定向克隆至腺病毒穿梭質粒pShuttle-CMV,接著用電穿孔法轉化至含有骨架質粒pAdEasy-1的E.coli BJ5183/p中進行同源重組,脂質體法將腺病毒重組質粒轉染至HEK293細胞,,利用HEK293細胞中表達的腺病毒E1蛋白將重組體包裝成含有hBMP-4基因的完整非復制型腺病毒,病毒顆粒感染HEK293和HeLa細胞,提取總RNA和總蛋白,進行RT-PCR和Western-blot檢測。 結果 獲得了含有目的基因的非病毒真核表達載體pcDNA3.1(+)/hBMP-4,經酶切、測序構建正確,RT-PCR和Western-blot檢測可以表達hBMP-4;構建成功非復制型腺病毒表達載體(?)AdE/hBMP-4,酶切提示構建正確,RT-PCR檢測到hBMP-4基因的轉錄,Western-blot檢測到hBMP-4蛋白表達。 結論 將目的基因hBMP-4克隆至非復制型腺病毒表達載體中,為進一步研究其在骨缺損基因治療中的應用奠定基礎。
[Abstract]:Objective to construct a non-replicating adenovirus expression vector containing human bone morphogenetic protein-4 gene and detect the expression of the target gene in order to study the gene therapy of bone tissue engineering. Methods the target gene fragment of EcoR 鈪
本文編號:1808165
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