本文選題：乙型肝炎病毒 + α-干擾素��； 參考：《中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志》2007年06期

【摘要】：目的確定乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶末端蛋白(terminal protein,TP)抗α-干擾素(IFN-α)的功能區(qū)域。方法PCR擴(kuò)增IFN-α誘導(dǎo)人類6-16基因啟動(dòng)子并克隆入pCAT-Basic中,構(gòu)建IFN-α反應(yīng)報(bào)告載體p6-16CAT。以FuGENE6轉(zhuǎn)染該報(bào)告載體至Huh7細(xì)胞并給予不同濃度IFN-α2a刺激,ELISA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氯霉素乙�；D(zhuǎn)移酶(CAT)的表達(dá),建立Huh7細(xì)胞對(duì)IFN-α反應(yīng)強(qiáng)弱的定量判定標(biāo)準(zhǔn)。構(gòu)建TP(包括Spacer區(qū))基因缺失突變體重組真核表達(dá)載體,通過(guò)融合表達(dá)的多肽表位抗體,Western blot法檢測(cè)目的蛋白在Huh7細(xì)胞中的表達(dá)。重組表達(dá)載體分別與報(bào)告載體p6-16CAT共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后48 h給予終濃度為100 IU/ml的IFN-α2a刺激,作用24 h后裂解細(xì)胞,通過(guò)檢測(cè)胞內(nèi)CAT含量高低評(píng)價(jià)各缺失突變體抗IFN-α作用,并據(jù)此確定TP(包括Spacer區(qū))抗IFN-α作用的功能區(qū)域。結(jié)果獲得6-16基因啟動(dòng)子并構(gòu)建IFN-α反應(yīng)報(bào)告載體p6-16CAT。轉(zhuǎn)染p6-16CAT的Huh7細(xì)胞在IFN-α2a刺激下CAT表達(dá)顯著增強(qiáng),且在IFN-α2a終濃度為100 IU/ml時(shí)達(dá)到最大。West- ern blot顯示TP(包括Spacer區(qū))各基因缺失突變體在Huh7細(xì)胞中表達(dá)相應(yīng)蛋白。共轉(zhuǎn)染p6-16CAT及部分/全長(zhǎng)TP的Huh7細(xì)胞在IFN-α2a刺激下,胞內(nèi)CAT值和對(duì)照組相比無(wú)顯著差別,相反,全長(zhǎng)TP+部分/全長(zhǎng)Spacer使細(xì)胞內(nèi)CAT值顯著下降。結(jié)論DNA聚合酶Spacer區(qū)與HBV抗IFN-α作用密切相關(guān)。
[Abstract]:Objective to determine the functional region of hepatitis B virus (HBV) terminal terminal protein (TPTP) against interferon 偽 (IFN- 偽).Methods IFN- 偽 -induced human 6-16 gene promoter was amplified by PCR and cloned into pCAT-Basic. The IFN- 偽 response report vector p6-16CAT was constructed.The expression of chloramphenicol acetyltransferase (FuGENE6) was detected by FuGENE6 transfection into Huh7 cells with different concentrations of IFN- 偽 2a. The quantitative criteria for the response of Huh7 cells to IFN- 偽 were established.The eukaryotic expression vector of body weight group with deletion mutation of TP- (including Spacer) gene was constructed, and the expression of the target protein in Huh7 cells was detected by Western blot assay with fusion expressed polypeptide epitope antibody.The recombinant expression vector co-transfected Huh7 cells with the report vector p6-16CAT. After 48 h of transfection, the cells were stimulated with 100 IU/ml IFN- 偽 2a at the final concentration. After 24 h, the cells were lysed. The effect of the deletion mutants against IFN- 偽 was evaluated by detecting the CAT content in the cells.The functional regions of TP- (including Spacer region) against IFN- 偽 were determined.Results the 6-16 gene promoter was obtained and the IFN- 偽 response report vector p6-16 CAT was constructed.The expression of CAT was significantly increased in p6-16CAT transfected Huh7 cells stimulated by IFN- 偽 2a, and reached the maximum when the final concentration of IFN- 偽 2a was 100 IU/ml. West- blot showed that TP- 偽 2a gene deletion mutants (including Spacer region) expressed the corresponding protein in Huh7 cells.Under the stimulation of IFN- 偽 2a, the intracellular CAT values of p6-16CAT and partial / full length Huh7 cells were not significantly different from those of the control group. On the contrary, the full length TP partial / full length Spacer significantly decreased the intracellular CAT value.Conclusion the Spacer region of DNA polymerase is closely related to the anti-IFN- 偽 effect of HBV.
【作者單位】： 福建醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究中心;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(30300015) 福建省重大科技基金(2002F005) 福建省高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)培育計(jì)劃基金
【分類號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：1739661