本文選題：衰老 + 心肌��； 參考：《山西醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 研究背景和目的 衰老是機(jī)體隨年齡增加而發(fā)生的所有現(xiàn)象的集中體現(xiàn)。隨著時(shí)間的推移,衰老將逐漸導(dǎo)致機(jī)體功能障礙,最終導(dǎo)致死亡。因此,可以把衰老定義為機(jī)體對(duì)內(nèi)、外環(huán)境改變發(fā)生的年齡依賴性的易損性增加,即機(jī)體逐漸減弱了對(duì)生理刺激的應(yīng)答能力。衰老的心臟心功能降低,但其機(jī)制仍不清楚。大量研究發(fā)現(xiàn),人類和動(dòng)物衰老過程中出現(xiàn)大量心肌細(xì)胞丟失。由于心肌細(xì)胞不能再生,衰老心臟的這種細(xì)胞丟失很可能是導(dǎo)致其心功能障礙的機(jī)制之一,但這一推測(cè)需要更多的研究證實(shí)。 細(xì)胞死亡的主要形式有主動(dòng)性死亡和被動(dòng)性死亡。主動(dòng)性死亡主要包括凋亡,而被動(dòng)性死亡主要指壞死。由于凋亡是一種基因控制的主動(dòng)過程,所以抑制凋亡的發(fā)生可能比阻止壞死更容易做到。我們及同行的研究證明,阻斷細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程可以明顯改善心功能。生理情況下,凋亡受多種促凋亡分子和抑凋亡分子之間平衡的控制,如果能特異性尋找衰老心臟中激活的促凋亡分子或被破壞的促/抑凋亡分子平衡,并解釋其中失衡機(jī)制,可能為特異性防止甚至扭轉(zhuǎn)這種細(xì)胞丟失提供新的領(lǐng)域。 活性氧簇(Reactive Oxygen Species,ROS)是已知的衰老過程中蛋白修飾和細(xì)胞損傷的重要介質(zhì)。但衰老動(dòng)物心肌細(xì)胞凋亡的增加并不能單一用ROS的產(chǎn)生解釋。近年來大量研究資料表明,源于一氧化氮(Nitric Oxide,NO)的活性氮簇(Reactive Nitrogen Species,RNS)也是蛋白修飾和細(xì)胞損傷的重要介質(zhì)。NO由三種一氧化氮合酶(Endothelial NitricOxide Synthase,eNOS;Inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS;Neuronal Nitric Oxide Synthase,nNOS)催化L-精氨酸生成。 大量研究表明RNS具有抗凋亡和抑凋亡的雙重作用,濃度、胞內(nèi)時(shí)空分布、氧化還原狀態(tài)可能是RNS促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡的決定因素。生理狀態(tài)的NO(低濃度的NO)可直接與O_2生成NO_2,后者再與另一NO反應(yīng)生成N_2O_3,N_2O_3可作為NO~+供體,使蛋白質(zhì)發(fā)生S-亞硝基化,后者是NO抗凋亡效應(yīng)的主要途徑;而高濃度的NO(如iNOS催化生成的NO)可以與O_2~-反應(yīng)生成極為活躍的過氧亞硝基(ONOO),,它可以作為NO_2~+的供體導(dǎo)致蛋白質(zhì)的硝基化,后者是NO致凋亡效應(yīng)的主要途徑。細(xì)胞培養(yǎng)研究證明,衰老的內(nèi)皮細(xì)胞中S-亞硝基化蛋白質(zhì)含量下降,但衰老心臟心肌細(xì)胞的S-亞硝基化蛋白質(zhì)含量是否下降,以及衰老的心肌細(xì)胞凋亡增高的原因是否與其RNS的促凋亡和抑凋亡效應(yīng)失調(diào)有關(guān)還未確定。 NO不能直接引起蛋白質(zhì)S-亞硝基化,必需通過NO~+供體(N_2O_3)或NO丟失一個(gè)電子產(chǎn)生NO~+來參與這一過程。由于N_2O_3的生成需要2分子的NO,在細(xì)胞膜中脂溶性的NO與O_2更易聚集而生成NO~+供體---N_2O_3,從而使蛋白質(zhì)更易發(fā)生S-亞硝基化。由于eNOS是唯一與膜相關(guān)的NOS,其含量和活性很可能與蛋白質(zhì)S-亞硝基化密切相關(guān)。有研究資料表明,衰老動(dòng)物及培養(yǎng)的衰老細(xì)胞中eNOS的含量和活性下降,但老年大鼠心肌組織中的eNOS表達(dá)變化報(bào)道不一;此外,eNOS表達(dá)水平是否與S-亞硝基化蛋白質(zhì)含量相關(guān)還不清楚。 方法 (1)分別選取雄性成年(4-6月,n=10)和老年(22-24月,n=16)SD大鼠,設(shè)立成年大鼠組與衰老大鼠組,經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈插管進(jìn)入左心室,監(jiān)測(cè)心率、左心室壓力、左心室壓力變化最大速率和心肌收縮指數(shù)(Cardiac Index,CI)等心功能指標(biāo); (2)分別采用原位末端標(biāo)記法(Terminal deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP NickEnd Labeling,TUNEL)和caspase-3活性測(cè)定法檢測(cè)心肌組織中細(xì)胞凋亡發(fā)生情況; (3)采用免疫組化方法檢測(cè)心肌組織中的S-亞硝基化的蛋白質(zhì)和內(nèi)皮型-氧化氮合酶(eNOS)的分布及含量; (4)利用NitroGlo試劑盒(PerkinElmer)檢測(cè)心肌組織中S-亞硝基化的蛋白質(zhì)表達(dá)水平; (5)用Western-blot法檢測(cè)心肌組織中eNOS和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá); (6)硝基酪氨酸(Nitrotyrosine,NT)是體內(nèi)生成過氧亞硝基(ONOO~-)的標(biāo)志物,用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)檢測(cè)NT的表達(dá)。 結(jié)果 1.衰老大鼠心功能明顯降低 1.1心肌收縮功能的指標(biāo) CI為反映心臟收縮功能的指標(biāo)之一,與成年大鼠(CI:46.82±3.176 s~(-1))相比,衰老大鼠的相應(yīng)指標(biāo)(CI:39.23±1.62 s~(-1),P＜0.05)明顯下降; 1.2心肌舒張功能的指標(biāo) 與成年大鼠反映舒張能力的心功能指標(biāo)左室舒張壓(LeR Ventricular DiastolicPressure,LVDP:-1.16士0.35kPa)和左室舒張末壓(Left Ventricular End-DiastolicPressure,LVEDP:-0.70±0.43 kPa)相比,衰老大鼠的相應(yīng)各項(xiàng)心功能指標(biāo)(LVDP:0.16士0.17kPa,P＜0.01;LVEDP:1.25±0.35kPa,P＜0.01)明顯增高。 以上結(jié)果提示衰老大鼠的心肌收縮及舒張功能均明顯低于成年大鼠。 2.衰老大鼠的心臟相對(duì)質(zhì)量明顯降低 稱量成年大鼠(n=8)和衰老大鼠(n=26)的心重及體重并計(jì)算其心重/體重比。與成年大鼠心重(0.6l±0.04g)相比,衰老大鼠的心重(1.42±0.04g,P＜0.01)顯著增加,但與成年大鼠的心重/體重比(0.31%士0.01%)相比,衰老大鼠的心重/體重比(0.26%4±0.01%,P＜0.01)卻顯著下降; 3.衰老大鼠心肌細(xì)胞凋亡增加 3.1 TUNEL染色結(jié)果 TUNEL染色是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的一種較靈敏的方法,通過該方法分別對(duì)成年大鼠及衰老大鼠心肌組織進(jìn)行檢測(cè)、并計(jì)數(shù)凋亡指數(shù),結(jié)果顯示,成年大鼠心肌細(xì)胞凋亡率為0.86%±0.29%,衰老大鼠達(dá)到2.86%±0.43%,二者相比,衰老大鼠心肌細(xì)胞凋亡明顯增加(P＜0.05): 3.2 Caspase-3活性測(cè)定結(jié)果 Caspase-3是細(xì)胞凋亡最后通路的關(guān)鍵蛋白,其活性可以定量反映細(xì)胞凋亡發(fā)生情況。通過對(duì)大鼠心肌組織Caspase-3活性測(cè)定的結(jié)果表明,與成年大鼠的caspase-3比活性(1.00±0.028)相比,衰老大鼠的caspase-3的比活性(2.21±0.327,P＜0.01)顯著增高: 3.3衰老大鼠心肌細(xì)胞凋亡與心功能的相關(guān)性分析 3.1.1 Caspase-3活性與心肌收縮功能指標(biāo)CI呈負(fù)相關(guān) 大鼠心肌組織caspase-3活性與CI呈負(fù)相關(guān)(r=-0.772,P＜0.01),,即隨著caspase-3活性增高,CI降低.或者說,caspase-3活性越高,大鼠心肌收縮功能越差。我們的結(jié)果提示:老年大鼠心肌收縮功能下降可能與其凋亡水平增加有關(guān)。 3.1.2 Caspase-3活性與心肌舒張功能指標(biāo)LVDP呈正相關(guān)大鼠心肌組織caspase-3活性與LVDP呈正相關(guān)(r=0.718,P＜0.01),即隨著caspase-3活性增高,LVDP相應(yīng)增加,即caspase-3活性越,心肌舒張功能越差。提示:與成年大鼠相比,老年大鼠心肌舒張功能下降可能與其凋亡水平增加有關(guān)。 4.1衰老大鼠心肌組織硝基酪氨酸含量升高 本實(shí)驗(yàn)通過雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)成年大鼠和衰老大鼠心肌組織的NT的表達(dá)含量。結(jié)果表明,與成年大鼠的NT(0.858±0.143 ng/ml)相比,衰老大鼠的NT(1.545±0.194 ng/ml,P＜0.05)明顯升高,說明衰老大鼠心肌組織中有大量過氧亞硝基產(chǎn)生: 4.2心肌組織硝基酪氨酸含量與caspase-3活性呈正相關(guān) 大鼠心肌組織硝基酪氨酸含量與caspase-3活性呈正相關(guān)(r=-0.770,P＜0.01),即隨著硝基酪氨酸含量增高,caspase-3活性相應(yīng)增加�；蛘哒f,心肌組織中硝基酪氨酸含量越高,心肌細(xì)胞凋亡水平越高。這一結(jié)果提示我們:老年大鼠心肌組織凋亡水平增加可能與其硝基酪氨酸含量增高有關(guān)。 4.3衰老大鼠心肌組織S-亞硝基化的蛋白質(zhì)表達(dá)降低 采用免疫組化法和NitroGlo試劑盒(PerkinElmer)檢測(cè)成年大鼠(n=6)和衰老大鼠(n=6)心肌組織中S-亞硝基化的蛋白質(zhì)的分布及表達(dá)。與成年大鼠(41208±492)相比,衰老大鼠心肌組織中S-亞硝基化的蛋白質(zhì)(36472±1239,P＜0.01)顯著下降; 4.4心肌組織中S-亞硝基化的蛋白質(zhì)與caspase-3活性呈負(fù)相關(guān) 大鼠心肌組織的S-亞硝基化蛋白質(zhì)含量與caspase-3活性呈負(fù)相關(guān)(r=-0.767,P＜0.01),即隨著S-亞硝基化的蛋白質(zhì)含量降低,caspase-3活性增加�；蛘哒f,心肌組織中S-亞硝基化的蛋白質(zhì)含量越低,心肌細(xì)胞凋亡水平越高。提示:老年大鼠心肌組織凋亡水平增加可能與其S-亞硝基化蛋白質(zhì)的含量降低有關(guān)。 5.衰老大鼠心肌組織iNOS表達(dá)增高,eNOS表達(dá)降低 5.1衰老大鼠心肌組織iNOS表達(dá)升高 用Western-blot檢測(cè)成年大鼠和衰老大鼠心肌組織中iNOS表達(dá)水平。與成年大鼠的iNOS(125610±11765)相比,衰老大鼠的心肌組織的iNOS(235485±46070,P＜0.01)顯著升高; 5.2心肌組織中iNOS表達(dá)與硝基酪氨酸含量呈正相關(guān) 大鼠心肌組織中iNOS表達(dá)與硝基酪氨酸含量呈正相關(guān)(r=0.600,P＜0.05),即隨著iNOS表達(dá)增高,NT相應(yīng)增加。也可以說,心肌組織中iNOS表達(dá)越高,硝基酪氨酸含量越高。提示:老年大鼠心肌組織中硝基酪氨酸含量增高可能與其iNOS表達(dá)增加有關(guān)。 5.3衰老大鼠心肌組織中eNOS表達(dá)降低 用免疫組化法和Western-blot法檢測(cè)成年大鼠和衰老大鼠心肌組織中eNOS分布及表達(dá)。與成年大鼠(564.1±52.9)相比,衰老大鼠心肌組織中eNOS表達(dá)(268.4±57.5,P＜0.05)明顯下降。 5.4心肌組織中eNOS表達(dá)與S-亞硝基化的蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān) 大鼠心肌組織中eNOS表達(dá)與S-亞硝基化蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)(r=0.622,P＜0.05),即隨著eNOS表達(dá)下降,S-亞硝基化的蛋白質(zhì)含量相應(yīng)降低�；蛘哒f,心肌組織中eNOS表達(dá)越低,S-亞硝基化蛋白質(zhì)的含量越低。提示:老年大鼠心肌組織中S-亞硝基化的蛋白質(zhì)含量降低可能與其eNOS表達(dá)下降有關(guān)。 結(jié)論 1.衰老大鼠心肌細(xì)胞凋亡增加、心臟相對(duì)質(zhì)量下降、心功能明顯降低; 2.衰老大鼠心肌組織中,具有細(xì)胞毒性的ONOO大量生成,而保護(hù)心肌細(xì)胞的S-亞硝基化的蛋白質(zhì)含量下降,減弱其對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用。因此,衰老大鼠心肌組織中促凋亡和抑凋亡RNS的失衡,有可能通過促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡導(dǎo)致心肌細(xì)胞丟失,最終造成心臟收縮和舒張功能的下降。 3.與成年大鼠相比,衰老大鼠心肌組織中iNOS表達(dá)明顯增高;同時(shí),eNOS表達(dá)明顯下降。產(chǎn)生RNS的酶NOS,在衰老大鼠心肌組織中的表達(dá)失調(diào),很可能是導(dǎo)致其RNS失調(diào)的原因之一。 4.上述結(jié)果提示,產(chǎn)生RNS的酶的種類、RNS中的有毒產(chǎn)物和RNS的化學(xué)修飾等環(huán)節(jié)在心肌組織衰老過程中起重要作用。如果在臨床工作中采取降低iNOS活性、增加eNOS活性、清除ONOO~-或者補(bǔ)充S-亞硝基化蛋白質(zhì)等干預(yù)措施,可能將有助于減輕心肌組織的老化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R361

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1737375