本文選題：高遷移率族蛋白B1　切入點：晚期糖基化終末產(chǎn)物受體　出處：《第二軍醫(yī)大學》2007年碩士論文

【摘要】： 高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box-l, HMGB1)是一種DNA結(jié)合蛋白,因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳時的快速遷移而得名,是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的唯一的能在細胞外誘導細胞因子和活化炎癥細胞的核內(nèi)蛋白。HMGB1具有3個結(jié)構(gòu)域,即A、B、C區(qū),A和B區(qū)主要構(gòu)成HMGB1的非特異性DNA結(jié)合區(qū);C區(qū)可與其它蛋白相互作用來調(diào)節(jié)HMGB1與DNA的親和力。HMGB1分布十分廣泛,在多種器官組織(如淋巴組織、腦、肝、肺、心、脾、腎等)的細胞中均有表達,而其表達水平又與細胞分化程度相關,未分化細胞的表達水平較高。作為危險信號和炎癥介質(zhì),HMGB1的產(chǎn)生較TNF-α和IL-1等早期細胞因子晚,且持續(xù)時間較長,故有“晚期炎癥介質(zhì)”之稱,它通過兩種不同的途徑釋放至細胞外:活化炎癥細胞的主動分泌和壞死細胞的被動釋放。越來越多的文獻報道,HMGB1是引起急性炎癥反應的重要因素,HMGB1也可在胞漿內(nèi)表達或分泌到細胞外,與膿毒癥、肺動脈高壓、肺炎癥損傷、內(nèi)毒素血癥、關節(jié)炎、滑膜炎等疾病的發(fā)生密切相關。因此,尋找針對HMGB1的抑制劑,而有效的降低炎癥的致死率,是本課題的要解決的重要問題。 與HMGB1結(jié)合的高親和力的配體是晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products, RAGE),RAGE是在內(nèi)皮細胞中發(fā)現(xiàn)的,屬免疫球蛋白超家族成員,由400多個氨基酸組成,相對分子質(zhì)量約35 000,分為胞外段、跨膜段和胞內(nèi)段。其胞外部分包含了一個“V”型區(qū)和兩個“C”型區(qū),與HMGB1結(jié)合的主要部位位于N端的“V”型區(qū)。RAGE廣泛分布于單核/巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞、腎系膜細胞、神經(jīng)細胞及平滑肌細胞等細胞表面,與HMGB1結(jié)合以后會出現(xiàn)上調(diào)表達,啟動一個正反饋環(huán),產(chǎn)生多種細胞因子、對某些干細胞產(chǎn)生趨化作用、誘導血管粘附分子產(chǎn)生,使細胞持續(xù)處于激活狀態(tài),最終導致組織損傷。 α-黑素細胞刺激素(alpha-melanocyte stimulating hormone,α-MSH)是一種內(nèi)源性神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)肽,通過結(jié)合黑皮質(zhì)素受體(Melanocortin Receptor MCR)來發(fā)揮退熱、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。實驗證明α-MSH對一些早期致炎因子起到了一定的抑制作用,但由于其對MC1-R和MC3-R有較高的選擇性,對MC4-R和MC5-R的親和力很低,而不能高效、持久、穩(wěn)定地發(fā)揮作用。雖然[Nle4,D-Phe7]α-MSH(NDP-MSH)是目前較為理想的α-MSH類似物,具備了高效、作用持續(xù)時間長、蛋白水解酶抵抗性強、穩(wěn)定性高、可溶性好等優(yōu)點,抗炎效果也優(yōu)于α-MSH,但也是由于其受體的選擇性不高,并且還有明顯的色素沉著作用,有可能影響其它生理功能,故臨床應用受到限制。本實驗應用的α-黑素細胞刺激素新型類似物——多肽39是基因工程、蛋白質(zhì)工程與化學修飾相結(jié)合的新生產(chǎn)物,這種利用軟件InsightⅡ?qū)Ζ?MSH結(jié)構(gòu)進行修飾,合成新型的類似物不僅對受體(MC1-R和MC5-R)具有很強的選擇性,而且對實驗性內(nèi)毒素休克有顯著的保護作用,能有效的減少肺、心、肝、腎、腦等臟器的炎癥反應,這些特性為此新型化合物的臨床應用提供了一定的科學依據(jù)。本課題的創(chuàng)新點在于,第一、α-MSH對于HMGB1及其受體RAGE是否具有調(diào)控作用,未見有人報道,我們從基因、蛋白兩個方面做了大量實驗,證實α-MSH可下調(diào)HMGB1及RAGE的表達。第二、多肽39是根據(jù)α-MSH結(jié)構(gòu)由本實驗室自主合成的全新的多肽化合物。第三、經(jīng)實驗證實多肽39對HMGB1及其受體RAGE的下調(diào)作用強于α-MSH及NDP-MSH,有效的控制了炎癥的發(fā)生。 第一部分α-黑素細胞刺激素及其類似物對內(nèi)毒素血癥小鼠表達高遷移率族蛋白1及其受體的調(diào)控作用 首先對HMGB1及其受體RAGE在內(nèi)毒素血癥小鼠模型中的動態(tài)表達情況進行了檢測,將BALB/c小鼠隨機分成4組(A～D組),每組9只,A組為PBS對照組,其余3組參考Galanos的方法,小鼠腹腔內(nèi)注射(ip)LPS(25μg/kg)和D-Gal(100 mg/kg)(PBS稀釋)建立內(nèi)毒素血癥小鼠模型,分別于18 h(B組)、24 h(C組)、32 h(D組)后,取腦、肺、肝、腎、脾等組織,采用RT-PCR和Western Blot方法從基因和蛋白水平檢測了HMGB1及其受體RAGE的表達情況。結(jié)果顯示:HMGB1及其受體RAGE均在(ip)LPS 18 h有所表達,24 h表達到高峰,32 h HMGB1的表達量仍維持在較高水平,而RAGE的表達量在32 h明顯減少,與對照組相比較有統(tǒng)計學差異(P0.01),并且HMGB1及其受體RAGE在肺、肝的表達量遠高于其它組織。在此基礎上,本實驗又觀察了α-MSH及其類似物NDP-MSH和多肽39調(diào)控HMGB1及其受體RAGE表達的時效關系。運用已建立的內(nèi)毒素血癥小鼠模型,按照給藥時間不同,將BALB/c小鼠隨機分成5組(A～E組),每組9只,A組為PBS對照組,B組為LPS對照組,C組、D組、E組小鼠分別在(ip) LPS后1 h、2 h、3 h注射2.5 mg/kg的三種多肽,24 h后處死小鼠,取肺、肝等組織,應用RT-PCR和Western Blot的方法鑒定。結(jié)果顯示:在注射LPS后2 h之內(nèi)分別給予三種多肽,能明顯抑制HMGB1和RAGE的表達,與對照組相比較有統(tǒng)計學差異(P0.01)。α-MSH使HMGB1及其受體RAGE的表達量減少35%～40%,NDP-MSH使HMGB1及其受體RAGE的表達水平下降55%～60%,多肽39可使HMGB1的產(chǎn)生降低60%～65%,作用優(yōu)于α-MSH和NDP-MSH。 第二部分α-黑素細胞刺激素及其類似物在體外對U937細胞表達高遷移率族蛋白1及其受體的調(diào)控作用 用含有10%小牛血清的1640培養(yǎng)基,在37℃,5%CO2的條件下培養(yǎng)人單核細胞系U937細胞。觀察體外培養(yǎng)的U937細胞經(jīng)LPS刺激后表達HMGB1及其受體RAGE的動態(tài)變化。根據(jù)收集細胞的時間不同,將其分為5組,用100 ng/ml LPS刺激U937細胞,分4個時間段(6 h, 12 h, 18 h, 24 h)收集細胞,提取蛋白和mRNA,應用Western blot和RT-PCR的方法測定HMGB1和RAGE的表達。結(jié)果顯示:100ng/ml LPS刺激U937細胞18 h HMGB1表達到高峰,其受體RAGE表達高峰期早于HMGB1,但在18 h仍能維持較高水平,與對照組相比有統(tǒng)計學差異(P0.01),故我們選擇18 h做為后續(xù)實驗的最優(yōu)時間點。在此基礎上,對α-MSH及類似物調(diào)控U937細胞表達HMGB1及其受體RAGE的時效關系進行了檢測。將U937細胞接種于24孔板,按照給藥時間不同,分為5組(A～E組),A組為PBS對照組,B組為LPS對照組, C組、D組、E組為100ng/ml LPS刺激1 h、2 h、3 h后分別將濃度為10-7M的三種多肽加入到培養(yǎng)體系中,18 h后收集細胞進行檢測。結(jié)果顯示:細胞經(jīng)100 ng/ml LPS刺激后,于2 h之內(nèi)給藥,HMGB1及其受體RAGE的表達量明顯減少,并且與α-MSH、NDP-MSH相比,多肽39的抑制作用更強(P0.05),與體內(nèi)實驗的結(jié)果基本一致。另外,本實驗觀察了α-MSH及類似物對U937細胞表達HMGB1及其受體RAGE表達調(diào)控的量效關系。將U937細胞接種于24孔板,依據(jù)三個濃度梯度(10-5M、10-7M、10-9M)將細胞分成五組(A～E組),A組為空白對照組,B組為LPS對照組,C組、D組、E組用100 ng/ml LPS刺激細胞1 h內(nèi)將10-5M、10-7M、10-9M三種濃度的三種多肽分別加入到培養(yǎng)體系中,18 h后收集細胞,運用Western blot和RT-PCR的方法從基因、蛋白兩個水平進行檢測。結(jié)果顯示:10-5M、10-7M的多肽39和NDP-MSH能有效下調(diào)HMGB1及其受體RAGE的表達,而α-MSH在10-7M時作用效果比較理想。 目前HMGB1與RAGE結(jié)合誘導細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導主要涉及兩條通路。一條涉及Rac和Cdc42途徑,導致細胞骨架重建;另一條涉及Ras-MAPK途徑和隨后核因子NF-κB移位介導的炎癥反應。另有實驗顯示,抑制HMGB1與RAGE的相互作用能阻斷p44/p42、p38、SAP/JNK MAPK和NF-κB活化。HMGB1介導的平滑肌移位能使MAPK途徑激活且使磷酸化的ERK1和ERK2移位到細胞核。因此,我們結(jié)合LPS影響的信號途徑選擇其中二個重要的相關信號分子,即p38及NF-κB,初步探索α-MSH及其兩個類似物對HMGB1與RAGE涉及的信號通路的調(diào)節(jié)作用。Western blot的結(jié)果顯示,α-MSH及相關類似物明顯抑制了p38的表達。另外,三種多肽對LPS誘導的NF-κB的表達也有顯著的下調(diào)作用。本研究結(jié)果展示了HMGB1-RAGE信號途徑與LPS信號途徑之間存在交互作用,對進一步認識機體的炎癥反應機制及其精細調(diào)控,以及新型治療手段的發(fā)現(xiàn)提供了潛在新思路。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R341

【共引文獻】

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本文編號：1693374