發(fā)布時(shí)間：2018-03-14 09:03

  本文選題：人胚胎干細(xì)胞　切入點(diǎn)：成骨細(xì)胞　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2005年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：目的: 探討人體細(xì)胞核移植來(lái)源的兔-人胚胎干細(xì)胞(SCNT-rhESCs)體外保持未分化狀態(tài)的擴(kuò)增能力及其人胚胎干細(xì)胞特性,著重探討 SCNT-rhESCs 在體外向成骨表型細(xì)胞分化的潛能和條件,嘗試為骨組織工程探尋一種含有人自體基因、無(wú)免疫排斥反應(yīng)、具有高分化潛能的全新種子細(xì)胞。 方法: 應(yīng)用已建立的人體細(xì)胞核移植來(lái)源的兔-人胚胎干細(xì)胞(SCNT-rhESCs)系體外擴(kuò)增培養(yǎng) 50 代后,進(jìn)行系統(tǒng)的干細(xì)胞特性鑒定并進(jìn)行體外成骨定向誘導(dǎo)分化研究。采用機(jī)械法收集 SCNT-rhESCs,首先在體外懸浮培養(yǎng)形成含有三個(gè)胚層(內(nèi)、中、外胚層)定向祖細(xì)胞的擬胚體(Embryoid body,EB)。7 天后,將擬胚體轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行貼壁培養(yǎng),分組進(jìn)行成骨定向誘導(dǎo)研究:一組為成骨誘導(dǎo)組,采用含抗壞血酸(50mg/L)、地塞米松 (1×10-8 mol/L)、β-甘油磷酸(10mmol/L)、15%胎牛血清的α-MEM 礦化培養(yǎng)基;另一組為非誘導(dǎo)組,采用僅含 15%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基;采用具有成骨能力的胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)作為實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照。各組細(xì)胞均置于 37℃,5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。采用倒置顯微鏡適時(shí)觀測(cè)誘導(dǎo)過(guò)程中的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;通過(guò)茜素紅染色、堿性磷酸酶(Gomori-鈣鈷法)染色、S-P 法免疫組化及免疫熒光染色檢測(cè)骨鈣素(Osteocalcin, OCN)以及Ⅰ型膠原的表達(dá)以鑒定成骨誘導(dǎo)后的細(xì)胞表型。 結(jié)果: SCNT-rhESCs 在體外擴(kuò)增培養(yǎng) 50 代后,仍能保持未分化狀態(tài)并具有人胚胎 干細(xì)胞特性。表現(xiàn)為:人胚胎干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志 SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60等陽(yáng)性,而鼠胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)志 SSEA-1 陰性,細(xì)胞核型正常,DNA 微衛(wèi)星遺傳標(biāo)志分析顯示其基因型與供體細(xì)胞完全一致,并且 SCNT-rhESCs 可以在體外自發(fā)分化形成擬胚體。同時(shí),擬胚體貼壁培養(yǎng)后在成骨誘導(dǎo)劑的作用下 2-3 周時(shí)有成骨表型細(xì)胞出現(xiàn),表現(xiàn)為:倒置鏡下細(xì)胞呈多偽足或鱗片樣,能形成茜素紅染色陽(yáng)性的骨結(jié)節(jié);成熟成骨細(xì)胞標(biāo)志——堿性磷酸酶染色陽(yáng)性;S-P 法免疫組化及免疫熒光染色示骨組織中的主要膠原蛋白成分——Ⅰ型膠原以及骨組織中的主要的非膠原蛋白成分、成骨晚期標(biāo)志物——骨鈣素均呈陽(yáng)性,提示 SCNT-rhESCs 在體外經(jīng)成骨誘導(dǎo)劑的定向誘導(dǎo)后可以產(chǎn)生穩(wěn)定的成骨表型細(xì)胞。而非誘導(dǎo)組SCNT-rhESCs 則形態(tài)各異,在不同時(shí)間段內(nèi)部分自發(fā)分化成為神經(jīng)元樣細(xì)胞、脂肪樣細(xì)胞、肌肉樣細(xì)胞以及其他未定型細(xì)胞,未觀察到有明顯的成骨表型細(xì)胞出現(xiàn)。 結(jié)論: 1.人體細(xì)胞核移植來(lái)源的兔-人胚胎干細(xì)胞——SCNT-rhESCs 可在體外進(jìn)行擴(kuò)增且能保持干細(xì)胞的未分化特性和多向分化潛能。 2.同時(shí),在成骨誘導(dǎo)劑的作用下 SCNT-rhESCs 可以分化成為穩(wěn)定的成骨表型細(xì)胞。 因此,由 SCNT-rhESCs 來(lái)源的成骨細(xì)胞可以作為胚胎早期骨發(fā)生、發(fā)育的研究模型并可為骨組織工程提供全新的包含人自體基因、無(wú)免疫排斥反應(yīng)的新種子細(xì)胞。
[Abstract]:Objective:
To explore the source of human nuclear transplantation in rabbit human embryonic stem cells (SCNT-rhESCs) and its ability to maintain amplification of embryonic stem cell characteristics in an undifferentiated state in vitro, to study SCNT-rhESCs cells to differentiate into osteoblasts phenotype potential and conditions in vitro, find a gene containing human autologous bone tissue engineering, without immune rejection. With high differentiation potential of new seed cells.
Method:
The application of the established human somatic cell nuclear transfer from rabbit human embryonic stem cell line (SCNT-rhESCs) cultured in vitro after 50 generations, the system of stem cell characterization and in vitro differentiation of bone orientation. Collect SCNT-rhESCs by mechanical method, first suspended in vitro formation containing three germ layers (in., ectoderm) embryoid body oriented progenitor cells (Embryoid body, EB).7 days, the embryoid bodies into cell culture plates in adherent culture, grouping osteogenic induction study: a group of osteogenic induction group, with ascorbic acid (50mg/L), dexamethasone (1 x 10-8 mol/L), beta glycerophosphate (10mmol/L), alpha -MEM mineralization in 15% fetal bovine serum medium; another group of non induced group, using only a -MEM containing 15% fetal bovine serum medium; with osteogenic ability of fetal bone marrow mesenchymal stem cells (MSC) as the experiment The positive control groups. Cells were placed in the temperature of 37 DEG 5%CO2 saturated humidity incubator, timely observation training. The morphological changes of the cells during induction by inverted microscope; by alizarin red staining, alkaline phosphatase (Gomori- calcium cobalt method) staining, S-P immunohistochemistry and immunofluorescence staining of osteocalcin (Osteocalcin, OCN) and the expression of collagen I in the identification of a cell phenotype induced by bone.
Result:
After 50 generations of culture in vitro, SCNT-rhESCs can still remain undifferentiated and have human embryo.
The characteristics of stem cells. For human embryonic stem cell specific surface markers SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 positive, and embryonic stem cell surface marker SSEA-1 negative cells, normal karyotype, DNA microsatellite genetic marker analysis showed that the genotype is consistent with the donor cells, and SCNT-rhESCs can differentiate spontaneously in vitro embryoid body. At the same time, the embryoid wall after cultured in considerate osteogenic agent under the effect of 2-3 weeks of osteogenic phenotype cells, showed: cells under inverted microscope showed many pseudopodia or scales, can form bone nodules alizarin red staining positive; mature osteoblasts -- alkaline phosphatase staining; S-P method of immunohistochemistry and immunofluorescence staining of collagen components are shown in the bone tissue of type I collagen and bone tissue in the main non collagen, bone markers osteocalcin were advanced Positive tip induced directional SCNT-rhESCs in vitro osteogenic inducer can produce bone phenotype cells into stable and non induced group SCNT-rhESCs is different in different period, part of spontaneous differentiation into neuron like cells, fat cells, muscle cells and other undifferentiated cells, was observed there appear obvious osteogenic phenotype of cells.
Conclusion:
1., rabbit human embryonic stem cells derived from human cell nuclear transfer, SCNT-rhESCs can be amplified in vitro and can maintain the undifferentiated and pluripotent differentiation potential of stem cells.
2. at the same time, the osteogenic agent under the action of SCNT-rhESCs can differentiate into bone cells into a stable phenotype. Therefore, SCNT-rhESCs derived osteoblasts can be used as early embryonic bone development and research, the model can provide a new gene containing autologous bone tissue engineering, without immune rejection of new seed cells.

【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類(lèi)號(hào)】：R329

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