本文選題：胎兒　切入點：骨髓間充質(zhì)干細胞　出處：《青島大學》2005年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:為糖尿病細胞替代治療提供理想的種子細胞,分別行胎兒骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)、胎兒胰腺源性干細胞(PSCs)以及構(gòu)建人自體基因的胚胎干細胞(SCNT-hES)向胰島樣細胞的定向誘導分化,動態(tài)觀察誘導分化細胞形態(tài)的時空變化及階段特異性抗原表達,對終末分化細胞進行定性鑒定及功能檢測。 方法:(1)取自然流產(chǎn)胎兒的股骨、脛骨等長骨骨髓,采用全骨髓培養(yǎng)法,按1x10~6/ml的密度接種至含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中,5%CO_2箱中孵育48h后換液,每3d換液1次,細胞貼壁生長呈成纖維樣,1:3傳代繼續(xù)擴增培養(yǎng),取3-8代MSCs予以2—巰基乙醇、EGF、bFGF、B27及尼克酰胺分三階段定向誘導分化為胰島樣細胞。(2)同時取胎兒胰腺體組織,機械破碎,膠原酶及胰酶消化,離心后將單細胞懸液種植于含10%FBS及1XB27的高糖DMEM培養(yǎng)基中,48h后培養(yǎng)液改換為含2%FBS及1XB27的DMEM-F12培養(yǎng)液,1:2消化傳代。觀察加ITS-A及EGF后細胞自發(fā)分化為神經(jīng)元及胰島樣結(jié)構(gòu),同時予以EGF、bFGF、B27及尼克酰胺分兩階段定向誘導分化。(3)取山東省干細胞工程技術(shù)研究中心自行建立的體細胞核移植胚胎干細胞系(SCNT-hES),采用六階段誘導分化:(一)用含15%FBS及2—巰基乙醇的高糖DMEM預分化3d;(二)用含15%FBS的高糖DMEM懸浮培養(yǎng)6d形成類胚體(EBs);(三)EBs加入含ITS-A和纖維結(jié)合素的DMEM-F12貼壁培養(yǎng)6d;(四)將細胞消化接種于含N2、B27及bFGF的DMEM-F12中擴增胰前體細胞6d;(五)撤掉bFGF加入尼克酰胺促進胰島細胞形成;(六)胰島細胞進一步成熟。對三種不同來源的各期細胞分別進行形態(tài)學觀察、雙硫腙染色、免疫細胞組織化學及共聚焦顯微鏡免疫熒光鑒定nestin、PDX-1、insulin及glucagon的表達,并用電化學發(fā)光法定量測定胰島素分泌量。 結(jié)果:(1)胎兒MSCs于接種后24h即可見到貼壁生長的成纖維樣細胞,8—9d達到80%融合,其后進入對數(shù)生長期,細胞倍增時間為30h,誘導過程中細胞逐漸變圓,表達nestin、PDX-1、insulin和glucagon,雙硫腙染色見棕紅色細胞團,MSCs分化得到的胰島樣細胞胞漿胰島素分泌量為81.3±23.6uu/ml,有一定程度葡萄糖依賴性
[Abstract]:Objective: to provide the ideal seed cells for the treatment of diabetic cell replacement, and to induce differentiation into islet like cells of fetal bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs), fetal pancreatic stem cells (PSCs) and human autologous gene derived embryonic stem cells (SCNT-hESs), respectively. The temporal and spatial changes of differentiation cells and the expression of stage specific antigen were observed dynamically. The terminal differentiation cells were identified qualitatively and their functions were detected. Methods the bone marrow of femur and tibia of abortive fetus was taken. The bone marrow of femur and tibia was cultured by whole bone marrow culture method. The bone marrow was inoculated into the DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) at the density of 1 x 10 / ml, and incubated in box 5CO 2 for 48 hours and then changed solution once every 3 days. The cells grew in fibroblast like 1: 3 and then expanded and cultured. The 3-8 passages of MSCs were treated with 2-mercaptoethanol, EGFbFGFB27 and nicotinamide in three stages to induce differentiation into islet like cells. Meanwhile, the fetal pancreatic tissue was extracted, and the tissue of fetal pancreas was mechanically broken. Collagenase and trypsin digestion, After centrifugation, the single cell suspension was planted in high sugar DMEM medium containing 10s and 1XB27 for 48 h. The culture medium was replaced with DMEM-F12 medium containing 2S and 1XB27 after 48 hours. The cells differentiated spontaneously into neurons and islet like structures after adding ITS-A and EGF. At the same time, EGFNbFGFB27 and nicotinamide were used to induce differentiation in two stages. (3) SCNT-hESN, a somatic cell nuclear transfer embryonic stem cell line established by Shandong Stem Cell Engineering Research Center, was obtained. Pre-differentiation of S and 2-mercaptoethanol with high sugar DMEM for 3 days (2) suspension culture of high sugar DMEM containing 15s for 6 days to form embryoid DMEM (3) EBs added with DMEM-F12 containing ITS-A and fibronectin for 6 days (4) cells digested and inoculated with N2B27 and bFGF. (5) removing bFGF and adding nicotinamide to promote the further maturation of islet cells. Dithizone staining, immunohistochemistry and confocal microscopy immunofluorescence were used to detect the expression of PDX-1 insulin and glucagon in Neisin, and the amount of insulin secretion was measured by electrochemiluminescence. Results Fetal MSCs could reach 80% fusion at 8-9 days after inoculation, then entered logarithmic growth period, the cell doubling time was 30h, and the cells became round during induction. The expression of PDX-1insulin and glucagon.Dithizone staining showed that the cytoplasmic insulin secretion of islet like cells was 81.3 鹵23.6uU / ml, which was dependent on glucose to some extent.
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2005
【分類號】：R329.2

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本文編號：1604061