本文選題：克隆　切入點(diǎn)：CTD磷酸酶　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2005年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：RNA聚合酶Ⅱ是真核生物中負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)基因的多亞基復(fù)合體,其最大亞基含有一個(gè)獨(dú)特的羧基末端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain,CTD),CTD的可逆磷酸化修飾在調(diào)控轉(zhuǎn)錄的起始、延伸、mRNA處理等活動(dòng)中扮演重要角色。目前已確定的人CTD激酶有很多種,而CTD磷酸酶則只有FCP1、SCP1和PP1。 我們首先從人類胎腦cDNA文庫以及多組織成人cDNA文庫中克隆到4個(gè)可能的CTD磷酸酶基因UBCP1,Tim50L1,MCP1及DUH,它們編碼的蛋白都含有與FCP1和SCP1相同的CTD磷酸酶催化結(jié)構(gòu)域。UBCP1的cDNA全長2215bp,編碼含318個(gè)氨基酸的蛋白。該基因定位在人類染色體5q33.3區(qū)域,含有11個(gè)外顯子,跨度為22.7kb。UBCP1基因在各組織中的表達(dá)較廣泛,在胎盤、肺、睪丸、卵巢組織中的表達(dá)量較高,而心、肝、腎、脾、直腸及外周血白細(xì)胞等組織的表達(dá)水平相對(duì)較低。EST分析、SAGE分析以及RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果均一致地表明UBCP1在腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著上調(diào),提示其與腫瘤具有相關(guān)性。原核表達(dá)的GST-UBCP1對(duì)磷酸酶通用底物pNPP具有磷酸酶活性,與FCP1和SCP1一樣,其最適pH在5.0附近,且活性依賴于Mg~(2+)。定點(diǎn)突變分析確定了6個(gè)對(duì)UBCP1磷酸酶活性有關(guān)鍵作用的保守氨基酸以及4個(gè)重要位點(diǎn),大多數(shù)位點(diǎn)在FCP1及SCP1中也是高度保守的。提示UBCP1與FCP1及SCP1在結(jié)構(gòu)及催化機(jī)理上的一致性。UBCP1對(duì)CTD具有明顯的去磷酸化作用,并且優(yōu)先作用于CTD重復(fù)序列中的第5位Ser,表明它是一個(gè)新的人類CTD磷酸酶并具有位點(diǎn)偏好性。除了CTD磷酸酶結(jié)構(gòu)域,UBCP1的N端具有一個(gè)泛素類似結(jié)構(gòu)域(ubiquitin-like domain,UBLD),UBLD中含有一個(gè)蛋白酶體相互作用基序(proteasome-interacting motif,PIM),提示UBCP1可能與蛋白酶體有相互作用。的確,我們通過酵母雙雜交篩選到一個(gè)蛋白酶體的亞基HsN3,體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明了UBCP1與HsN3相互作用的特異性,但UBLD對(duì)這種相互作用并不是必需的。綠熒光融合蛋白表達(dá)顯示了UBCP1定位在細(xì)胞核內(nèi),并且UBLD對(duì)于UBCP1的入核有重要影響。在COS-7細(xì)胞中過表達(dá)UBCP1可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,提示過表達(dá)UBCP1抑制RNAPⅡ轉(zhuǎn)錄活性的可能性。 Tim50L1是Tim50的一個(gè)剪接體,它們的差異在于N端的不同,Tim50L1缺失了Tim50具有的信號(hào)肽及跨膜區(qū),造成了細(xì)胞定位的顯著差異,Tim50定位在線粒體膜上,而Tim50L1主要定位于細(xì)胞核。EST分析顯示它有可能在某些腫瘤組織中特異表達(dá)。Tim50L1編碼240個(gè)氨基酸,其磷酸酶性質(zhì)與其他CTD磷酸酶有顯著差異,它在pH4.5及8.0附近活性最高,最適離子是Mn~(2+),最適溫度在60℃附近。Tim50L1也對(duì)磷酸化的CTD表現(xiàn)出明顯的去磷酸化作用,說
[Abstract]:RNA polymerase 鈪，

本文編號(hào)：1603231