發(fā)布時間：2018-03-07 14:22

  本文選題：肝素酶　切入點：樹突狀細胞　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： [背景和目的] 生物治療是繼手術(shù)、放療和化療之后臨床治療惡性腫瘤的第四種治療模式。隨著對機體抗腫瘤免疫機制的深入研究，人們已經(jīng)認識到誘發(fā)體內(nèi)細胞毒T淋巴細胞(Cytotic T Lymphocyte，CTL)發(fā)揮抗瘤作用的并不是整個腫瘤抗原分子，而是與MHC分子結(jié)合的短肽即CTL表位(epitopes)，因此，尋找特異性腫瘤抗原及其相應(yīng)的CTL表位成為腫瘤免疫治療的關(guān)鍵。樹突狀細胞(Dendritic cells,DC)作為體內(nèi)最強大的抗原提呈細胞，是免疫應(yīng)答過程的始動者和調(diào)節(jié)者。負載CTL表位的DC疫苗因其免疫原性好、副作用小、便于應(yīng)用等優(yōu)勢而成為目前抗腫瘤治療研究的一個熱點。 肝素酶(Heparanase，Hpa)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，在正常組織中僅低表達于淋巴細胞和骨髓等免疫組織，但在幾乎所有的轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤細胞中普遍存在，而且表達的水平與腫瘤的轉(zhuǎn)移、TMN分期等臨床預(yù)后不良指標明顯相關(guān)，肝素酶已成為中晚期腫瘤治療的一個良好靶位。那么肝素酶能否作為一種腫瘤相關(guān)抗原用于腫瘤的免疫治療?我們過去的研究表明，肝素酶全長基因負載的DC體外可以誘導(dǎo)肝素酶特異性CTL，對肝素酶陽性且MHC相匹配的胃癌細胞具有殺傷作用，而對肝素酶陽性但MHC不相匹配的胃癌細胞不具有殺傷效應(yīng)，提示肝素酶氨基酸全長序列中一定存在能誘導(dǎo)特異性CTL反應(yīng)的抗原表位。 本研究的目的在于尋找存在于肝素酶全長序列中的能夠有效激發(fā)機體抗腫瘤效應(yīng)的CTL表位。鑒于HLA-A2．1是中國人群中最為常見的HLAⅠ類分子的型別，陽性率高達50％，因此鑒定腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)抗原Hpa的HLA-A2．1限制性CTL表位將會對中國人群中肝素酶表達陽性的惡性腫瘤提供免疫治療的基礎(chǔ)。 [方法] 1、采用超基序和量化基序相結(jié)合的方法對肝素酶的HLA-A2．1限制性CTL表位進行預(yù)測，并用分子模擬技術(shù)模擬表位肽與MHC分子結(jié)合的空間構(gòu)象，分析結(jié)合參數(shù)以進一步提高預(yù)測的準確性，然后從結(jié)果中選取得分較高的5條肝素酶表位肽進行合成、純化、分子量鑒定，利用T_2細胞的特點對合成的候選肽與HLA-A2．1分子的進行親和力分析；采用標準~(51)Cr釋放實驗檢測上述肝素酶表位肽負載DC后誘導(dǎo)的肝素酶特異性CTL對KATO-Ⅲ胃癌細胞的免疫殺傷效應(yīng)，從而篩選出能夠有效激活CTL反應(yīng)的肝素酶抗原表位。 2、采用密度梯度離心法分離并得到人外周血單個核細胞，利用rhGM-CSF、rhIL-4及rhTNF-α誘導(dǎo)擴增人成熟樹突狀細胞，并從形態(tài)學(xué)、細胞表面CD分子進行鑒定；用上述篩選的候選肽負載DC誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性CTL，采用標準~(51)Cr釋放實驗檢測肝素酶特異性CTL對KATO-Ⅲ胃癌細胞(Hpa~+，HLA-A2．1~+)、U-2OS骨肉瘤細胞(Hpa~+，HLA-A2．1~+)、SW480結(jié)腸癌細胞(Hpa~+，HLA-A2．1~+)、MCF-7乳腺癌細胞(Hpa~-，HLA-A2．1~+)、HepG2肝癌細胞(Hpa~+，HLA-A2．1~-)以及轉(zhuǎn)染了肝素酶全長基因的MCF-7／Hpa乳腺癌細胞(Hpa~+，HLA-A2．1~+)和轉(zhuǎn)染了HLA-A2．1基因的HepG2／HLA-A2．1肝癌細胞(Hpa~+，HLA-A2．1~+)的免疫殺傷效應(yīng)；采用HLA-A2．1單克隆抗體封閉上述靶細胞的HLA-A2．1位點，或以CD8單克隆抗體封閉效應(yīng)細胞的CD8位點，再用肝素酶表位特異性CTL殺傷KATO-Ⅲ胃癌細胞，以研究篩選的肝素酶表位是否受HLA-A2．1限制以及CTL效應(yīng)細胞的來源；采用標準~(51)Cr釋放實驗研究肝素酶特異性CTL對自體淋巴細胞的免疫殺傷活性，以確定其可能存在的毒副作用；采用ELISPOT技術(shù)檢測肝素酶特異的效應(yīng)細胞IFN-γ釋放情況。 3、將上述篩選的肝素酶候選表位負載C57BL／6-Tg(HLA-A2．1)1Enge／J小鼠骨髓來源的DC(mDC)后，免疫小鼠三次，取其脾淋巴細胞作為效應(yīng)細胞，采用~(51)Cr釋放實驗檢測肝素酶特異性CTL對KATO-Ⅲ、U2OS、SW480、MCF-7、MCF-7／Hpa、HepG2、HepG2／HLA-A2．1細胞以及自體淋巴細胞和mDC的殺傷效應(yīng)；ELISPOT技術(shù)檢測肝素酶特異的效應(yīng)細胞IFN-γ釋放情況。 [結(jié)果] 1、采用超基序和量化基序方法聯(lián)合預(yù)測出5條得分最高肝素酶表位肽：Hpa(525-533)(PAFSYSFFV)、Hpa(353-361)(PLLSDTFAA)、Hpa(277-285)(KMLKSFLKA)、Hpa(400-408)(PLPDYWLSL)、Hpa(405-413)(WLSLLFKKL)；T_2細胞親和力分析發(fā)現(xiàn)預(yù)測的5條多肽均能與T_2細胞有效結(jié)合；采用標準~(51)Cr釋放實驗檢測上述肝素酶表位肽負載DC后誘導(dǎo)的肝素酶特異性CTL對KATO-Ⅲ胃癌細胞的免疫殺傷效應(yīng)，結(jié)果表明，Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)誘導(dǎo)的CTL對KATO-Ⅲ胃癌細胞具有明顯的殺傷效應(yīng)，而Hpa(353-361)和Hpa(400-408)誘導(dǎo)的CTL對KATO-Ⅲ胃癌細胞的殺傷效應(yīng)與陰性肽相同，提示Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)可能是肝素酶特異性抗原表位。 2、采用密度梯度離心法分離HLA-A2．1陽性健康志愿者外周血中的單個核細胞(PBMC)，用重組人細胞因子GM-CSF、IL-4及TNF-α聯(lián)合誘導(dǎo)擴增，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察以及采用流式細胞術(shù)對細胞表面CD分子進行鑒定，成功制備了PBMC來源的成熟DC；采用標準~(51)Cr釋放實驗檢測Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)表位負載DC后誘導(dǎo)的肝素酶特異性CTL對不同來源腫瘤細胞的免疫殺傷效應(yīng)，結(jié)果表明，肝素酶特異性CTL對肝素酶陽性且HLA-A2．1陽性的KATO-Ⅲ、U2OS和SW480細胞具有明顯的殺傷效應(yīng)，而對肝素酶陰性但HLA-A2．1陽性的MCF-7細胞和肝素酶陽性但HLA-A2．1陰性的HepG2細胞均不具有殺傷效應(yīng)，但對轉(zhuǎn)染了肝素酶全長基因的MCF-7細胞(MCF-7／Hpa)和轉(zhuǎn)染了HLA-A2．1全長基因的HepG2細胞(HepG2／HLA-A2．1)重新產(chǎn)生明顯的免疫殺傷效應(yīng)，，提示肝素酶抗原表位誘導(dǎo)的CTL反應(yīng)是肝素酶特異、且受HLA-A2．1限制；用HLA-A2．1和CD8分子的單抗分別封閉靶細胞表面的HLA-A2．1位點和效應(yīng)細胞表面的CD分子后再進行殺傷實驗，結(jié)果表明肝素酶特異性CTL對封閉了HLA-A2．1的KATO-Ⅲ細胞無明顯殺傷效應(yīng)，封閉了CD8的效應(yīng)細胞對KATO-Ⅲ細胞亦無明顯殺傷效應(yīng)，進一步提示這種殺傷效應(yīng)是HLA-A2．1限制，CTL效應(yīng)細胞來源于CD8陽性的T淋巴細胞；采用標準~(51)Cr釋放實驗驗檢測上述肝素酶抗原表位誘導(dǎo)的肝素酶特異性CTL對自體淋巴細胞的免疫殺傷效應(yīng)，結(jié)果表明肝素酶特異性CTL對自體淋巴細胞無明顯殺傷效應(yīng)，提示肝素酶多肽疫苗的安全性(表1)；采用ELISPOT技術(shù)檢測肝素酶特異性效應(yīng)細胞IFN-γ的分泌能力，結(jié)果表明，肝素酶抗原表位能促進效應(yīng)細胞IFN-γ的分泌。 3、用上述肝素酶表位肽負載C57BL／6-Tg(HLA-A2．1)1Enge／J小鼠骨髓來源的DC(mDC)，然后免疫小鼠三次，取其脾淋巴細胞作為效應(yīng)細胞，以不同來源的多種腫瘤細胞作為靶細胞，用~(51)Cr釋放法檢測殺傷效應(yīng)，實驗結(jié)果表明，肝素酶表位特異性的CTL對肝素酶陽性且HLA-2陽性的KATO-Ⅲ、U2OS和SW480細胞具有明顯的殺傷效應(yīng)，而對肝素酶陰性但HLA-A2．1陽性的MCF-7細胞和肝素酶陽性但HLA-A2．1陰性的HepG2細胞均不具有殺傷效應(yīng)，但對感染了肝素酶全長基因的重組腺病毒(rAd-Hpa)的MCF-7乳腺癌細胞(MCF-7／rAd-Hpa)和轉(zhuǎn)染HLA-A2．1的HepG2／HLA-A2．1細胞亦重新產(chǎn)生明顯的殺傷效應(yīng)，對自體淋巴細胞和mDC亦無明顯殺傷效應(yīng)(表1)。ELISPOT技術(shù)檢測肝素酶抗原表位能有效促進肝素酶特異性效應(yīng)細胞分泌IFN-γ。 [結(jié)論] 1、采用超基序和量化基序法并通過體外殺傷實驗從肝素酶的全長氨基酸序列中篩選出了3條HLA-A2．1限制的CTL表位，即Hpa(525-533)(PAFSYSFFV)、Hpa(277-285)(KMLKSFLKA)、Hpa(405-413)(WLSLLFKKL)，以上肝素酶抗原表位與德國學(xué)者的報道不同。 2、從體外及動物實驗二方面證實肝素酶抗原表位Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生肝素酶特異性CTL，對肝素酶陽性且HLA-A2．1相匹配的腫瘤細胞具有很強的免疫殺傷活性，對肝素酶陰性或HLA-A2．1陰性的腫瘤細胞不具有殺傷效應(yīng)，但對轉(zhuǎn)染了肝素酶或HLA-A2．1的腫瘤細胞具有殺傷效應(yīng)，提示肝素酶抗原表位誘導(dǎo)的CTL反應(yīng)是肝素酶特異且受HLA-A2．1限制，肝素酶特異性CTL主要來源于CD8陽性T淋巴細胞。 3、從體外及動物實驗二方面證實肝素酶特異性CTL對自體淋巴細胞和／或DC無明顯的免疫殺傷活性，提示肝素酶多肽疫苗臨床應(yīng)用的安全性。 4、從體外及動物實驗二方面證實肝素酶抗原表位Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)負載的DC可以促進效應(yīng)細胞IFN-γ釋放。 以上研究表明，人肝素酶特異性抗原表位[Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)]不僅能激發(fā)機體特異性的抗腫瘤效應(yīng)，而且還能誘導(dǎo)一個非特異性抗腫瘤的良性循環(huán)，這種肝素酶多肽疫苗具有廣譜、高效、特異、安全的優(yōu)點，為肝素酶表位多肽疫苗的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻】

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6 熊菲,程茜;樹突狀細胞培養(yǎng)技術(shù)的研究進展[J];國外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊;2005年04期

7 江繼發(fā),魏海明;檢測腫瘤轉(zhuǎn)移指標的臨床意義[J];國外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊);1998年02期

8 陳陵;蔡永國;鄭興春;楊仕明;房殿春;羅元輝;王東旭;;負載肝素酶復(fù)制缺陷型腺病毒的包裝及鑒定[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2006年01期

9 朱波,陳正堂,程曉明,林治華,吳玉章;腫瘤抗原TRAG-3 HLA-A2.1限制性CTL表位的鑒定[J];免疫學(xué)雜志;2004年06期

10 周光炎，范麗安;HLA：新的進展和新的起點──記第12屆國際組織相容性會議[J];上海免疫學(xué)雜志;1996年06期

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本文編號：1579656