本文選題：漢灘病毒　切入點：囊膜糖蛋白　出處：《第四軍醫(yī)大學》2007年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)是由漢坦病毒(Hantanvirus,HV)引起的一種急性病毒性傳染病,臨床上以發(fā)熱、出血、腎功能損害和免疫功能紊亂為突出表現。我國是世界上HFRS疫情最嚴重的國家,流行地區(qū)廣、發(fā)病人數多、病死率較高,防治任務十分艱巨。 HV屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)漢坦病毒屬。目前可將HV分為十種血清型或二十幾種基因型,其中常見的對人類造成危害比較嚴重的型別有:漢灘病毒(HTNV)、漢城病毒(SEOV)、普馬拉病毒(PUUV)、辛若柏病毒(SNV)等。 以往國內外的大量研究工作表明,HV的M基因編碼的囊膜糖蛋白(Glycoprotein,GP)是重要的結構蛋白,HV的中和抗原表位主要分布在GP上,特別是G2上。GP可刺激機體產生中和抗體,對感染動物和人體均具有保護作用。此外,GP還具有血凝活性、細胞融合活性及受體結合活性,因此GP被認為是一種重要的保護性抗原,是漢坦病毒基因工程疫苗的主要候選成份。但是,該蛋白免疫原性較弱,已有的抗GP的抗體親和(結合)活性均不高,并且在目前應用比較廣泛的幾種表達系統(tǒng)中,GP表達水平亦不理想。因此也尚未建立針對GP的有效的檢測方法,這些都使得對GP的研究受到了很大的限制。 本研究根據GP上既有中和活性位點又有血凝活性位點的特點,利用HTNV 76-118株血凝素免疫小鼠制備單克隆抗體(mAb),并以含有G1、G2編碼基因的真核載體G1-pDisplay、G2-pDisplay轉染的CHO細胞篩選抗G1和G2的特異性mAb,對這些mAb的免疫學特性進行了初步鑒定;同時將編碼HTNV 76-118株G2的基因片段分別克隆入畢赤酵母胞內型表達載體pPIC3.5K和分泌型表達載體pPICZαA,轉化酵母工程菌株,篩選陽性轉化子并進行了誘導表達。 1.抗HTNV G1、G2 mAb的制備及鑒定 以蔗糖-丙酮法從HTNV 76-118株感染的乳鼠腦中提取血凝素,以此血凝素免疫BLAB/c小鼠,取免疫小鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合,以血凝抑制試驗(HIA)進行篩選,獲得了4株能穩(wěn)定分泌抗HTNV血凝素mAb的雜交瘤細胞系,分別命名為1A6、1G12、2B2和2H5。 用分別含有編碼HTNV G1和G2基因的真核表達載體G1-Display、G2-Display轉染CHO細胞,并用此轉染細胞檢測上述4株mAb。結果表明,mAb 1G12與G1-Display轉染CHO細胞呈陽性反應,提示其是G1特異性的;2B2和2H5均與G2-Display轉染CHO細胞呈陽性反應,提示它們是G2特異性的;而1A6則與G1-Display轉染CHO細胞和G2-Display轉染CHO細胞均呈陽性反應。 采用HIA檢測mAb 1A6、1G12、2B2、2H5腹水的血凝抑制效價,結果分別為1∶4000、1∶16000、1∶16000和1∶8000。中和試驗的結果表明,4株mAb均有一定的中和活性,最高中和效價為1∶40。 2.HTNV G2蛋白在畢赤酵母中的表達與鑒定 將HTNV 76-118株G2基因片段分別克隆入畢赤酵母胞內型載體(pPIC3.5K)和分泌型載體(pPICZαA),構建了含有編碼HTNV G2蛋白基因的表達載體pPIC3.5k-G2和pPICZαA-G2,分別轉化畢赤酵母工程菌后用甲醇誘導表達。用SDS-PAGE和Western-Blot對表達產物進行鑒定。結果表明,pPICZαA-G2轉化菌表達產物中有與預期大小相符的目的蛋白條帶,采用抗his的mAb及HFRS患者恢復期血清的Western-Blot,證實該條帶為G2蛋白。 本研究獲得的針對HTNV GP(G1、G2)的特異性mAb以及HTVN G2蛋白,為進一步建立HTNV GP的檢測方法以及HTNV GP的結構與功能研究等提供了物質基礎。
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【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：1566464