本文關鍵詞：高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病理學研究及其病毒的序列分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學》 2010年

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病理學研究及其病毒的序列分析

劉永宏  

【摘要】： 豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)引起豬的一種傳染病,表現(xiàn)為母豬生殖衰竭和仔豬、成年豬呼吸困難,是影響?zhàn)B豬業(yè)最大的傳染病之一。PRRSV屬于動脈炎病毒科成員,基因組長度約為15kb～15.5kb,至少含有9個開放閱讀框架,編碼20種以上成熟的蛋白質。根據(jù)基因型和抗原性的差異將PRRSV分為北美洲型和歐洲型兩種,各自代表株分別為VR-2332株和LV株。2006年在中國暴發(fā)了空前規(guī)模巨大的豬高熱癥,感染豬達200萬頭以上,至少40萬頭死亡,這給中國經(jīng)濟帶來巨大的損失,也嚴重威脅了全球養(yǎng)豬業(yè)和世界公共衛(wèi)生。 本研究為了分析豬高熱癥的真正原因,通過對北京各郊區(qū)縣和周邊地區(qū)15個豬養(yǎng)殖場(戶)55個病例進行發(fā)病情況、流行病學調查和臨床癥狀觀察,以及通過對發(fā)病豬和病死豬剖檢、病理組織學觀察、免疫組化染色和電鏡觀察,同時對冰凍病料和血清做了核酸和抗體檢測。研究結果表明:PRRSV核酸陽性率為60%,豬圓環(huán)病毒2型(Porcine Circovirus Type 2, PCV-2)核酸陽性率為32.7%,PRRSV和PCV-2混合感染率為18.2%;此次豬高熱癥的主要病原是PRRSV,發(fā)病特點不同于以往典型的PRRS,同時有PCV-2的混合感染;PRRS病理組織學病變?nèi)褐饕獮殚g質性肺炎、非化膿性腦炎、出血性壞死性淋巴結炎、急性炎性脾腫、變質性心肌炎、急性間質性腎炎伴隨腎病和出血、壞死性扁桃體炎、母豬子宮內(nèi)膜炎、變質性肝炎和肝細胞可見胞漿內(nèi)嗜酸性包涵體;PRRSV陽性臟器為肺臟、脾臟、淋巴結、扁桃體、腦、肝臟、腎臟、腎上腺、胃腸和心臟;PRRSV陽性細胞為單核-巨噬細胞、黏膜上皮細胞、淋巴細胞、血管內(nèi)皮細胞、腺上皮細胞(肺上皮細胞、肝細胞、腎小管上皮細胞等)、杯狀細胞、纖維細胞、成纖維細胞、心肌細胞、神經(jīng)細胞、膠質細胞和軟骨細胞。 為了分析此次疫情高發(fā)病率和高死亡率的原因,本研究將4份沒有接種PRRS疫苗RT-PCR鑒定為單一PRRSV陽性的病料,接種MARC-145細胞進行病毒分離,經(jīng)RT-PCR、IFA和電鏡鑒定,表明分離到4株病毒且均為PRRSV,其TCID50均為10-6.5/0.1mL,命名為BJSY-1、BJPG、BJSD和BJBLZ株。進一步設計了相互重疊的16段引物,RT-PCR產(chǎn)物直接純化、測序和拼接,得到4株PRRSV的全基因序列,運用分子生物學軟件進行比對和遺傳演化分析,結果顯示:本研究分離的BJSY-1、BJPG、BJSD和BJBLZ株基因全長分別為15319nt、15315nt、15345nt和15316nt,通過美國國立生物技術信息中心(NCBI)的審核,GenBank登錄號分別為FJ950744、FJ950746、FJ950747和FJ950745;本研究的4株與北美洲型毒株核苷酸同源性在83.3%～99.4%之間,與歐洲型毒株核苷酸同源性只有58.3%左右,均屬于北美洲型亞群Ⅱ,且屬于HP-PRRSV;ORF6基因與北美洲株同源性和歐洲株同源性均最高,其次是ORF2基因,再次是ORF7、ORF4和ORF5基因,同源性最低的是ORF3基因。 本研究選擇了HP-PRRSV BJSY-1株變異性最小的ORF6基因,設計合成了一對特異性引物,擴增ORF6基因片段克隆入原核表達載體pET-32a(+),重組質粒pET-ORF6轉化BL21宿主菌后,鑒定構建成功后摸索合適條件誘導表達M蛋白,純化回收得到了可溶性的具有免疫學反應活性的融合蛋白HIS-M,分子量約為39kDa。本研究得到了一種穩(wěn)定的、免疫原性好的抗原,為制備單抗或作為檢測抗原奠定了基礎。 考慮到PRRSV抗體和抗原雙陰性豬不易獲得,試圖尋找一種標準的且對PRRSV易感的實驗動物代替豬來研究PRRSV,同時為了驗證致病力增強的HP-PRRSV BJSY-1毒株是否可以感染其它動物。本研究對BALB/c小白鼠和日本大耳白兔進行了不同劑量的人工感染實驗,攻毒后觀察體溫、體重等變化,按照實驗設計定期剖檢取材進行PRRSV核酸檢測和病理學檢查。結果顯示:小白鼠和兔體溫、體重等無異常變化,PRRSV核酸檢測陰性,沒有出現(xiàn)PRRSV特異的病理組織學變化。本研究證實了HP-PRRSV不感染BALB/c小白鼠和日本大耳白兔。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：S858.28
【目錄】：

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