本文關(guān)鍵詞： 法尼酯X受體 肝細胞核因子1α 啟動子 葡萄糖　出處：《第三軍醫(yī)大學》2007年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 法尼酯X受體(farnesoid X receptor,FXR)因其天然配體為膽汁酸,又稱為膽汁酸受體,是一種配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子,屬于核受體超家族的一員。FXR主要表達于肝臟、小腸、腎及腎上腺等組織,在心臟和脂肪組織中也有一定水平的表達。FXR可與視黃酸X受體(retinoid X receptor, RXR)以異二聚體形式結(jié)合于靶基因啟動子的FXR反應元件,參與多種基因表達的調(diào)控,在膽汁酸負反饋調(diào)節(jié)、糖脂代謝中發(fā)揮重要作用。目前,FXR研究的重點主要集中在尋找FXR新的配體、靶基因以及探討其與核受體輔活化子之間相互作用等,對FXR轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究鮮有報道。事實上,FXR自身表達水平的改變是影響脂代謝平衡的重要因素,而FXR轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機制至今尚不清楚。許多參與碳水化合物代謝調(diào)節(jié)的基因都受葡萄糖或胰島素正性或負性調(diào)節(jié)。有研究表明葡萄糖也能調(diào)控FXR基因的轉(zhuǎn)錄。為研究FXR基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,探討高糖條件下FXR表達增高的機制,我們進行了如下的研究: 1.FXR啟動子生物信息學分析及轉(zhuǎn)錄起始位點的確定 預測軟件(http://www.fruitfly.org/ cgi-bin/seq_tools/promoter.pl.)提示,FXR基因5′側(cè)翼區(qū)的啟動子樣序列位于外顯子上游約1600bp范圍內(nèi)。應用transFac professional 8.1軟件對該區(qū)域進行搜索,獲得了多個可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,其中一個重要的結(jié)合位點是與細胞核因子1α(hepatocyte nuclear factor 1α, HNF1α)的結(jié)合位點。5′端cDNA末端快速擴增法(rapid amplification of cDNA ends, RACE)確定轉(zhuǎn)錄起始點的堿基為A。該轉(zhuǎn)錄起始點位于翻譯位點前380bp處,比已知的FXR_mRNA(U68233、NM005123)5′端第一個堿基長29 bp。 2.FXR啟動子的活性分析 構(gòu)建包含F(xiàn)XR基因5′上游序列的熒光素報告質(zhì)粒,利用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染肝細胞系,檢測熒光素酶活性。結(jié)果顯示啟動子活性最小區(qū)域位于 150/+29bp,其中-150～-74bp間存在較強的正性調(diào)控序列。定點突變實驗進一步證明-89～-84區(qū)域在FXR啟動子中發(fā)揮重要作用。 3.體內(nèi)、體外鑒定HNF1α與FXR啟動子活性區(qū)域的結(jié)合 染色質(zhì)免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)及電泳遷移率變動實驗(electrophoresis mobility shift and supershift assay, EMSA)實驗證明:HNF1α可在體內(nèi)、外與FXR啟動子區(qū)域相結(jié)合。 4.HNF1α調(diào)節(jié)FXR的轉(zhuǎn)錄活性 HNF1α真核表達質(zhì)粒與FXR啟動子重組報告基因載體或與突變體的共轉(zhuǎn)染實驗表明,HNF1α通過與FXR啟動子-89～-84區(qū)域結(jié)合,調(diào)控FXR啟動子的活性。Real time PCR和免疫印跡試驗(western blot, WB)證明:高表達HNF1α可上調(diào)HepG2細胞中FXR的表達。 5.葡萄糖對膽汁酸受體基因啟動子的調(diào)節(jié) 在分析FXR啟動子活性區(qū)域及鑒定相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基礎(chǔ)上,探討葡萄糖對FXR基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。實驗結(jié)果顯示,高糖作用下FXR啟動子活性增高, HepG2細胞內(nèi)HNF1α結(jié)合于FXR啟動子的活性增高;高糖能夠上調(diào)HepG2細胞內(nèi)FXR及HNF1α的表達。結(jié)果表明高糖誘導的FXR表達水平增加可能與HNF1α介導的FXR啟動子活性的增強有關(guān)。 本研究對人FXR基因5′側(cè)翼序列進行了系列缺失分析,鑒定了啟動子的活性區(qū)域,發(fā)現(xiàn)并證實了與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子HNF1α。在上述實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,我們還探討了葡萄糖在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控FXR表達的機制。FXR啟動子的鑒定及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的研究,對于我們深入認識FXR基因自身轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及FXR在生物體內(nèi)的生理和病理作用具有重要意義。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R346

【共引文獻】

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本文編號：1536600