本文關鍵詞： 腫瘤壞死因子-α 緩激肽 血腦屏障 熱休克因子-1 熱休克蛋白70 緊密連接相關蛋白 神經膠質瘤　出處：《中國醫(yī)科大學》2007年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 目的 一直以來，人們認為緩激肽(bradykinin，BK)開放血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的作用是由于血管內皮細胞上存在B2受體，緩激肽與其結合后引起血腦屏障結構和功能改變，導致血腦屏障開放。最近有研究發(fā)現，在正常腦組織和腫瘤的血管內皮細胞上未見緩激肽B2受體的表達，而在腫瘤細胞上發(fā)現了高水平表達的緩激肽B2受體，且B2受體表達程度與血腦屏障開放程度密切相關。由此可以推測緩激肽不是直接作用于血管內皮細胞引起血腦屏障變化，，而可能是緩激肽首先與腫瘤細胞上的B2受體結合，誘發(fā)腫瘤細胞釋放某種細胞因子或其他介質，進而作用于血腦屏障引起其結構和功能改變，導致血腦屏障開放。但其確切機制尚待探討。 在研究緩激肽開放血腫瘤屏障(blood-tumor barrier，BTB)的過程中，Inamura等經頸內動脈向腦膠質瘤大鼠緩慢小劑量灌注緩激肽15min后，血腫瘤屏障開放達最大，此后雖繼續(xù)灌注，但效應呈減弱趨勢，即緩激肽開放血腫瘤屏障過程中誘發(fā)了快速耐受性。有關緩激肽誘發(fā)腫瘤屏障開放產生快速耐受性的機制，目前尚不清楚。 本研究的目的就是為了明確，緩激肽與腫瘤細胞上的B2受體結合后到底引起何種細胞因子和／或遞質釋放，進而如何影響血腦屏障的開放的，以及緩激肽開放血腫瘤屏障過程中誘發(fā)快速耐受性的可能機制。 方法 1．復制大鼠C6膠質瘤模型按照Nicolau等報道的方法，收集培養(yǎng)的C6膠質瘤細胞1×10~5／5μL通過立體定位儀接種于動物大腦右側尾狀核，約15天形成荷瘤鼠。 2．采用伊文思蘭(evans blue，EB)和透射電鏡技術，檢測應用緩激肽前后荷瘤鼠血腦屏障滲透性及緊密連接改變。 3．采用伊文思蘭和透射電鏡技術，檢測應用腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)前后荷瘤鼠血腦屏障滲透性及緊密連接改變。 4．采用放射免疫法檢測應用緩激肽前后C6膠質瘤細胞培養(yǎng)液中TNF-α的含量。 5．采用Western blotting法檢測應用緩激肽前后C6膠質瘤細胞內熱休克因子1(heat shock factor 1，HSF1)和熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)的蛋白質表達水平。 6．采用RT-PCR技術檢測應用緩激肽前后C6膠質瘤細胞內TNF-αmRNA的轉錄水平。 7．免疫組織化學法檢測C6動物模型的腦腫瘤微血管于TNF-α作用前后的緊密連接相關蛋白occludin表達水平。 結果 1．成功復制了大鼠C6膠質瘤模型。 2．應用緩激肽后，C6膠質瘤大鼠血腫瘤屏障滲透性及緊密連接開放增加，于15min時出現高峰，60min時接近對照組水平。 3．應用TNF-α后，C6膠質瘤大鼠血腫瘤屏障滲透性及緊密連接開放增加，于15min時出現高峰，60min時接近對照組水平。 4．培養(yǎng)的C6膠質瘤細胞經緩激肽處理后，培養(yǎng)液中的TNF-α濃度增加，于15min時達高峰，60min時仍高于對照組。 5．培養(yǎng)的C6膠質瘤細胞經緩激肽處理后，HSF1和HSP70蛋白質的表達增加，且分別于緩激肽處理后5min和30min時表達最多，60min時仍高于對照組。 6．C6膠質瘤細胞經緩激肽處理后，細胞內TNF-αmRNA水平增加，于緩激肽處理后10min時出現高峰，其后逐漸減少，60min時達最低。 7．TNF-α作用于C6膠質瘤大鼠后，膠質瘤微血管上的緊密連接相關蛋白occludin表達減少。 結論 1．單獨應用緩激肽及TNF-α均可顯著增加C6膠質瘤大鼠血腫瘤屏障通透性及緊密連接開放程度，二者均于給藥15min后出現高峰，60min時接近對照組水平。 2．緩激肽促進了膠質瘤細胞內HSF1蛋白質和TNF-αmRNA的表達，并促進了TNF-α的釋放。三者的時程變化不同，HSF1的表達高峰于給予緩激肽5min后出現，TNF-αmRNA的表達高峰于給藥10min后出現，TNF-α釋放高峰于給藥15min后出現。提示增加的HSF1的表達可能促進了TNF-αmRNA的表達和TNF-α的釋放，這可能是緩激肽選擇性開放血腫瘤屏障的機制之一。 3．緩激肽引起膠質瘤組織內TNF-α含量達高峰與緊密連接相關蛋白occludin表達達低峰的時間點一致，相同時間點的血腫瘤屏障開放達最大。提示緩激肽開放血腫瘤屏障可能是通過TNF-α影響緊密連接相關蛋白occludin的表達而實現的。
[Abstract]:objective
All along, people think that bradykinin (bradykinin, BK) to open the blood brain barrier (blood-brain barrier, BBB) the effect is due to the presence of B2 receptors on vascular endothelial cells, combines with bradykinin induced changes of blood brain barrier function, leading to the opening of blood brain barrier. Recent studies have found that no bradykinin B2 receptor expression in the the normal brain tissue and tumor vascular endothelial cells, and the high level expression of bradykinin B2 receptor was found in tumor cells, and the expression of B2 is closely related with the blood brain barrier opening degree. It can be speculated that bradykinin is not a direct effect on vascular endothelial cells caused by changes of blood brain barrier, and may be the first with bradykinin B2 receptor on the tumor cells, tumor cells induced release of some cytokines or other media, and the effect on blood brain barrier caused by its structure and function change, blood lead The brain barrier is open, but its exact mechanism remains to be discussed.
In the tumor of bradykinin (blood-tumor barrier, open the blood-brain barrier BTB) in the process of Inamura via the carotid artery to the brain glioma in rats after 15min infusion of small doses of slow, blood tumor barrier opened to the maximum, then although continued perfusion, but the effect was decreased and that of bradykinin in opening blood tumor barrier in the process of inducing tachyphylaxis. Mechanism of bradykinin induced tumor barrier tachyphylaxis, is unclear.
The purpose of this study is to clear the combination of bradykinin and B2 receptor on the tumor cells after cause any cytokine and / or neurotransmitter release, and then how to affect the BBB, the possible mechanism of tachyphylaxis and bradykinin opening blood tumor barrier in the process.
Method
1., the rat C6 glioma model was duplicated. According to the method reported by Nicolau, the C6 glioma cells (1 x 10~5 / 5 L) were collected and inoculated on the right caudate nucleus of the animal brain by stereotactic apparatus. The tumor bearing mice were formed for 15 days.
2. Evans Lan (Evans blue, EB) and transmission electron microscopy were used to detect the permeability and close connection of blood brain barrier in the mice with bradykinin before and after the application of bradykinin.
3. by Evans blue and transmission electron microscopy, detection of tumor necrosis factor alpha (tumor alpha factor- alpha necrosis, TNF-) and the changes of tight junction tumor after the blood brain barrier permeability.
4. the content of TNF- alpha in the culture fluid of C6 glioma cells was detected by radioimmunoassay before and after the application of bradykinin.
5. the expression level of heat shock factor 1 (heat shock factor 1, HSF1) and heat shock protein 70 (heat shock protein 70, HSP70) in C6 glioma cells before and after bradykinin treatment were detected by Western blotting.
6. the transcriptional level of TNF- alpha mRNA in C6 glioma cells was detected by RT-PCR technique before and after the application of bradykinin.
7. immunohistochemical method was used to detect the expression of close linked protein occludin in the microvascular of brain tumor of C6 animal model before and after the action of TNF- alpha.
Result
1. the rat model of C6 glioma was successfully replicated.
2. after the application of bradykinin, the permeability and close connection of blood tumor barrier in C6 glioma rats increased, the peak was at 15min, and the level of the control group was close to the control group at 60min.
3. after the use of TNF- alpha, the permeability and close connection of blood tumor barrier in C6 glioma rats increased, the peak was at 15min, and the level of 60min was close to the control group.
4. the cultured C6 glioma cells were treated with bradykinin, the concentration of TNF- alpha in the culture medium increased and reached the peak at 15min, and was still higher than that of the control group at 60min.
5., after treated with bradykinin, the expression of HSF1 and HSP70 protein increased in C6 cultured glioma cells. The expression of HSF1 and HSP70 protein was the most in bradykinin treated 30min and 60min, respectively.
After treatment with bradykinin, the level of TNF- alpha mRNA in 6.C6 glioma cells increased, and the peak appeared at 10min after bradykinin treatment, then decreased gradually and reached the lowest level at 60min.
After the action of 7.TNF- alpha on C6 glioma rats, the expression of tight junction related protein occludin on the microvasculature of glioma was reduced.
conclusion
1. alone application of bradykinin and TNF- alpha significantly increased the permeability of blood tumor barrier and the degree of tight junction opening in the C6 glioma rats. Both of them showed a peak after the administration of 15min, and 60min approached the level of the control group at the time of 60min.
2. bradykinin promoted the expression of HSF1 protein in glioma cells and TNF- alpha mRNA, and promoted the release of TNF- alpha. Variation of the difference between the three, the peak expression of HSF1 in 5min after administration of bradykinin, the peak expression of TNF- alpha mRNA in 10min after administration, TNF- was released to high peak after treatment of 15min. Expression increase of HSF1 may promote the expression of mRNA and TNF- alpha TNF- alpha release, which may be one of the mechanisms of bradykinin selective opening of blood tumor barrier.
3. bradykinin TNF- alpha in glioma tissues reached the peak and tight junction protein occludin expression reached the peak of the low consistent point in time, the opening of the blood tumor barrier at the same time as that of bradykinin. The opening of blood tumor barrier may be through the TNF- alpha on the expression of TJ associated protein occludin and achieve.

【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R33

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