本文關(guān)鍵詞： 杜氏利什曼原蟲 DNA疫苗 amastin基因 ctxB基因　出處：《四川大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani，L．d)引起的內(nèi)臟利什曼病(visceral leishmaniasis，VL，又稱黑熱病)是利什曼病中癥狀最嚴(yán)重的一種類型，如不經(jīng)治療，病死率達(dá)90％以上。據(jù)WHO／TDR資料，全世界每年新增加50萬內(nèi)臟利什曼病病人，患病人數(shù)約250萬。目前，對內(nèi)臟利什曼病采取的主要控制措施仍然是使用葡萄糖酸銻鈉(五價銻劑)等藥物治療病人或捕殺病犬以控制傳染源，其次是使用驅(qū)蟲劑或殺蟲劑避免被傳播媒介白蛉叮咬。然而，抗內(nèi)臟利什曼病藥物普遍存在用藥時間長、副作用明顯、不能口服以及治療費用昂貴，，絕大多數(shù)發(fā)展中國家的病人無力承擔(dān)等問題。近年來，在一些發(fā)病地區(qū)甚至產(chǎn)生了針對葡萄糖酸銻鈉的抗藥株，加上艾滋病與內(nèi)臟利什曼病混合感染情況的出現(xiàn)，使內(nèi)臟利什曼病的防治形勢更加嚴(yán)峻。因此，研制出安全、有效、使用費用低廉的可供臨床大規(guī)模應(yīng)用的疫苗，對于控制內(nèi)臟利什曼病具有十分重要的現(xiàn)實意義。 近年來，被稱為第三代疫苗的核酸疫苗的出現(xiàn)，為內(nèi)臟利什曼病疫苗的研究提供了一個新的發(fā)展方向。目前，在此方面已有嘗試性的研究報道。本研究在查閱國內(nèi)外大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，首次選用杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蛋白(amastin)基因作為疫苗候選基因，并首次設(shè)計將霍亂毒素B亞單位(CTB)的編碼基因ctxB與amastin基因融合，構(gòu)建了含amastin基因的兩種DNA疫苗，免疫接種實驗小鼠，對它們的免疫原性和免疫保護(hù)性以及CTB的佐劑作用進(jìn)行了初步評價。本研究共分為五部分： 第一部分，以兩株杜氏利什曼原蟲基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得了與預(yù)期大小一致、約552bp的杜氏利什曼原蟲amastin基因。將amastin基因定向克隆入原核表達(dá)載體pET-32a(+)，構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-amastin和pET-dog-amastin，進(jìn)行測序和序列對比分析，并誘導(dǎo)pET-amastin在原核系統(tǒng)中表達(dá)出約40kD的融合蛋白。 第二部分，利用重疊PCR技術(shù)將ctxB基因與amastin基因進(jìn)行融合，得到ctxB／amastin融合基因，并將ctxB／amastin融合基因定向克隆入原核表達(dá)載體pET-32a(+)，構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-ctxB／amastin，誘導(dǎo)pET-ctxB／amastin在原核系統(tǒng)中表達(dá)出約54kD的融合蛋白。 第三部分，將amastin基因和ctxB／amastin融合基因定向克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-amastin和pcDNA3.1-ctxB／amastin，將pcDNA3.1-amastin和pcDNA3.1-ctxB／amastin體外轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞后，用免疫熒光法檢測到有效的瞬時表達(dá)，經(jīng)G418篩選后存活的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA經(jīng)RT-PCR分別擴(kuò)增出約552bp和921bp的目的條帶，證實轉(zhuǎn)入基因得到穩(wěn)定表達(dá)；Western blot檢測到轉(zhuǎn)染的陽性細(xì)胞克隆穩(wěn)定表達(dá)出20kD和34kD的目的蛋白。 第四部分，將構(gòu)建的真核表達(dá)重組質(zhì)粒用作DNA疫苗免疫BALB／c小鼠，檢測免疫小鼠體內(nèi)抗原特異性抗體水平、脾淋巴細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4產(chǎn)生水平以及CTL殺傷活性等指標(biāo)，評價疫苗的免疫原性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：pcDNA3.1-amastin和pcDNA3.1-ctxB／amastin免疫組的免疫原性均高于空白質(zhì)粒對照組(P＜0.01)；pcDNA3.1-ctxB／amastin免疫組的體液免疫和細(xì)胞免疫水平均高于pcDNA3.1-amastin免疫組，單因素方差分析顯示，差異有顯著性(P＜0.01)。 第五部分，將構(gòu)建的真核表達(dá)重組質(zhì)粒用作DNA疫苗免疫BALB／c小鼠，加強(qiáng)免疫后，用杜氏利什曼原蟲前鞭毛體對免疫小鼠進(jìn)行攻擊，攻擊6周后處死小鼠，取肝、脾印片檢查無鞭毛體數(shù)量情況，并做組織切片觀察肝、脾病理形態(tài)學(xué)變化，評價疫苗對動物的免疫保護(hù)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：pcDNA3.1-amastin和pcDNA3.1-ctxB／amastin免疫組小鼠肝、脾印片的無鞭毛體數(shù)量均低于空白質(zhì)粒pcDNA3.1(+)免疫組，pcDNA3.1-ctxB／amastin免疫組小鼠肝、脾印片的無鞭毛體數(shù)量低于pcDNA3.1-amastin免疫組。pcDNA3.1-amastin和pcDNA3.1-ctxB/amastin免疫組小鼠肝、脾病理變化明顯低于空白質(zhì)粒pcDNA3.1(+)免疫組。結(jié)果表明：含amastin基因的兩種DNA疫苗均可在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)效應(yīng)，ctxB/amastin融合基因免疫組的免疫保護(hù)效果似乎強(qiáng)于單純的amastin基因免疫組。 本研究結(jié)果表明：含amastin基因的兩種DNA疫苗具有較強(qiáng)的免疫原性，能誘導(dǎo)BALB／c小鼠產(chǎn)生一定程度的抗杜氏利什曼原蟲感染保護(hù)性免疫力，加入佐劑分子CTB的疫苗免疫原性和免疫保護(hù)性優(yōu)于單純的amastin基因疫苗免疫組。而且，ctxB／amastin融合基因免疫可誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。由于杜氏利什曼原蟲為胞內(nèi)寄生原蟲，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫效應(yīng)能夠抑制蟲體的增殖，對于抵御杜氏利什曼原蟲起著極其重要的作用，因此，構(gòu)建疫苗候選基因與佐劑分子的融合基因在內(nèi)臟利什曼病DNA疫苗研究中的意義更為突出。迄今為止，該研究未見國內(nèi)外報道。本研究為進(jìn)一步研制安全、有效的內(nèi)臟利什曼病疫苗奠定了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：四川大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【引證文獻(xiàn)】

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1 殷麗紅;蜥蜴利什曼原蟲對杜氏利什曼原蟲的交叉免疫保護(hù)研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

2 張麗娟;堆型艾美耳球蟲pcDNA3-3-1E的免疫效應(yīng)及其安全性研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

本文編號：1518274