發(fā)布時間：2018-02-10 05:54

  本文關鍵詞： 日本血吸蟲 性別差異表達 新基因 抑制性消減雜交 cDNA微陣列 RACE　出處：《華南農業(yè)大學》2006年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 血吸蟲病是由血吸蟲感染引起的一種分布廣泛、危害嚴重的人畜共患寄生蟲病。血吸蟲為吸蟲中罕見的雌雄異體,性別的分化對血吸蟲的發(fā)育及致病起著至關重要的作用。雌雄蟲合抱是血吸蟲雌蟲發(fā)育成熟和產卵的關鍵,成熟雌蟲所產生大量蟲卵而引起肝臟病變是造成宿主主要病理損害和疾病再傳播的前提�；诖吮菊撐拈_展了日本血吸蟲性別差異表達基因的篩選研究,并對部分差異表達新基因進行了克隆分析,以探索血吸蟲性別發(fā)育的分子機理,開拓免疫預防新途徑。 應用抑制性消減雜交技術構建了日本血吸蟲雄蟲和雌蟲的消減雜交文庫。消減效率分析表明同源基因經過消減雜交后得到了有效扣除,消減效率較高;重組比率及插入片斷長度分析結果表明雌蟲消減文庫的重組比率為92%,且85%的插入片斷大于500bp;雄蟲消減文庫的重組比率為91%,且90%以上的插入片斷大于500bp;對構建的日本血吸蟲雌雄蟲消減庫隨機挑選部分克隆測序,分別獲得64條雌蟲EST序列和62條雄蟲EST序列。同源性搜索結果表明分別代表了45和48個日本血吸蟲基因,雌蟲和雄蟲消減文庫的冗余率分別為29.7%和22.6%;所測EST序列共有25條與12種血吸蟲已知基因匹配,其中雌蟲消減文庫中與血吸蟲已知基因高度同源的有日本血吸蟲卵殼蛋白、卵黃鐵蛋白Ferrtin-1、fs800等基因。雄蟲消減文庫與已知血吸蟲基因高度同源的有肌動蛋白、原肌球蛋白等基因。這幾種血吸蟲基因已經被證實為性別差異表達基因,結果表明本研究所構建的日本血吸蟲性別差異消減文庫質量較高,可以用于性別差異表達基因的篩選研究。 利用cDNA微陣列技術在整個基因組水平上對日本血吸蟲性別差異表達基因進行篩選。從構建好的雌蟲和雄蟲兩個消減文庫中共挑選3072個克隆制成cDNA微陣列。芯片雜交后獲得953個雌蟲高表達和1014個雄蟲高表達的基因克隆。其中855個克隆經測序分析代表297個單基因,雌雄蟲分別為137個和160個。序列同源性搜索結果表明:297個單基因中,247個與已知EST有95%～100%同源性;雌蟲所代表的137個單基因中,蛋白功能已知的血吸蟲基因有18個,蛋白功能未知的血吸蟲基因96個,與已知EST高度同源的基因13個,其它物種基因2個,沒有同源性的新EST 8個。雄蟲所代表的160個血吸蟲單基因中,蛋白功能已知的血吸蟲基因30個,蛋白功能未知的血吸蟲基因109個,與已知EST高度同源的基因15個,其它物種基因1個,沒有同源性的新EST 5個。從中選取7個非冗余的差異表達基因克隆,用實時定量PCR進行了驗證,證明上述克隆確為血吸蟲性別差異表達的基因克隆,與芯片雜交結果一致。所測EST編碼蛋白的功能預測結果顯示:雌蟲消減文庫中與已知血吸蟲基因高度同源的有卵殼蛋白、卵黃鐵蛋白、fs800、RXR受體、組織蛋白酶B和組織蛋白酶L、過氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽還原酶等,提示多與血吸蟲的產卵、能量代謝、轉錄調節(jié)及抗氧化反應相關。雄蟲消減文庫與已知血吸蟲基因高度同源的有肌動蛋白、原肌球蛋白、肌球蛋白、膠原、22.6ku膜蛋白、23ku膜蛋白、鈣蛋白酶、calponin、鈣調蛋白、鈣網蛋白、熱激蛋白HSP60、HSP70、HSP90等。EST的編碼蛋白功能預測結果提示這類基因多為蟲體的結構蛋白與蟲體運動相關蛋白,參與離子調節(jié)與信號轉導、蛋白質的合成、轉運及分解代謝等。 應用RACE技術擴增了4個血吸蟲全長新基因cDNA。并利用生物信息學分析工具對新基因編碼蛋白的理化性質、跨膜結構、抗原位點進行了分析預測,對編碼蛋白的保守功能域、結構位點及其同源性蛋白進行了搜索。結果顯示雌蟲高表達f2基因編碼蛋白具有泛素和核糖體蛋白S30e的保守功能域。雄蟲高表達cm3基因編碼蛋白具有C2H2型鋅指結構的保守功能域,cm4編碼蛋白具有SPla/RYanodine receptor SPRY結構域。m1基因編碼蛋白可能是一種血吸蟲特有蛋白。對新基因生物學功能的深入研究,對于探索血吸蟲性別發(fā)育的分子機制、開發(fā)高效候選疫苗和藥物新靶標具有重要價值。
[Abstract]:Schistosoma japonicum is one of the most widely distributed and endangered species of human and livestock caused by infection of Schistosoma japonicum . It is the rare female of Schistosoma japonicum . The differentiation of sex is the key to the development and pathogenesis of Schistosoma japonicum . A subtractive hybridization library of male and female of Schistosoma japonicum was constructed by suppression subtractive hybridization . The results showed that the recombination ratio of the homologous gene was 92 % and the insertion fragment length was greater than 500 bp . A cDNA microarray was selected from two subtractive libraries of female worm and male worm . The results showed that there were more than two genes , such as egg shell , egg yolk ferritin , fs800 , RXR receptor , tissue proteinase B and tissue proteinase L , peroxidase ( SOD ) and glutathione reductase . The new gene cDNA of Schistosoma japonicum was amplified by RACE technique . The physicochemical properties , transmembrane structure and antigenic sites of the new gene - encoded protein were predicted by using bioinformatics analysis tools . The results showed that the gene - encoding protein of the female high - expression f2 gene had a conserved functional domain of ubiquitin and ribosomal protein S302.Results showed that the gene - encoding protein of the female high - expression f2 gene had a conserved domain of C2H2 zinc finger structure . The gene - encoding protein of male worm has SP1a / RYanodine receptor SPRY domain . The gene - encoding protein of male worm has important value for exploring the molecular mechanism of the sex development of Schistosoma japonicum , developing high - efficiency candidate vaccine and new target of drug .

【學位授予單位】：華南農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R383;S852.7

【引證文獻】

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1 郝言明;柔嫩艾美耳球蟲兩個抗藥株消減cDNA文庫的序列分析[D];福建農林大學;2010年

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本文編號：1499811