發(fā)布時間：2018-01-16 23:25

  本文關(guān)鍵詞：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 一、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及其生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)研究。 目的:建立一種簡單,快速的分離、純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并適宜其在體外大量快速增殖的方法;進(jìn)一步了解骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的各種生物學(xué)特性。 方法: 1無菌條件下取大鼠雙側(cè)股骨、脛骨和胸骨,并用吸取D-Hank’s液的注射器沖出骨髓細(xì)胞,置于含10%FBS、100U/ml雙抗的L-DMEM培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng),應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)法結(jié)合貼壁分離的方法進(jìn)行純化。待細(xì)胞達(dá)95%融合時,用0.125%的胰酶-0.02%的EDTA消化2-3min后進(jìn)行傳代。倒置顯微鏡下觀察原代及傳代后的細(xì)胞生長特點(diǎn)。2掃描電鏡(SEM)下觀察大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面的超微結(jié)構(gòu)特征。3 HE染色光鏡觀察大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)特征。4用MTT法測定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長曲線,從而進(jìn)一步了解其生長特性。 結(jié)果:原代培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞成分復(fù)雜,1-2天開始有少量細(xì)胞貼壁,形狀不規(guī)則,有長梭形、多角形等。半量換液后,克隆生長的細(xì)胞團(tuán)塊開始迅速增殖,以集落形式生長為主。7-9天左右細(xì)胞可長滿培養(yǎng)瓶底,達(dá)95%以上融合,主要呈紡錘形,其中散在少量折光性強(qiáng)的小圓形細(xì)胞。細(xì)胞整體排列更趨于規(guī)律性,呈漩渦狀,輻射狀或魚群樣排列。傳代后的細(xì)胞貼壁及生長更加迅速,2h后部分細(xì)胞即開始貼壁,24h內(nèi)即可完全貼壁,6-7天可鋪滿培養(yǎng)瓶底。細(xì)胞形態(tài)更均一,紡錘形生長,整體呈現(xiàn)漩渦狀,輻射狀或魚群樣排列。傳代10代以上,各代之間細(xì)胞生長均一,穩(wěn)定。HE染色示胞體以紡錘形居多,有突起。細(xì)胞核大、居中深染,嗜堿性,核仁明顯;胞質(zhì)著色淺,呈弱嗜酸性。P2、P4、P6細(xì)胞生長曲線基本相同,分為潛伏期(第1-2天)、對數(shù)生長期(第3-5天)和平臺期(第6-7天),且?guī)状?xì)胞間生長狀況穩(wěn)定。掃描電鏡下可見到三種形態(tài)的細(xì)胞:以寬大扁平形的細(xì)胞為主,長梭形和圓球形細(xì)胞占少數(shù)。胞體周圍的突起類似樹枝狀,并互相重疊,相互交織。細(xì)胞核大,圓形或橢圓形,核仁1-5個不等。表面可見大量短而粗的微絨毛樣突起。 結(jié)論:1本部分應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)法結(jié)合貼壁分離法成功建立了一種體外簡單、快速的分離、純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法,并使其在體外迅速得到了增殖,而且性狀穩(wěn)定。2細(xì)胞呈均一的紡錘形;P2、P4、P6細(xì)胞生長曲線基本相同,細(xì)胞增殖快,且?guī)状?xì)胞間生長狀況穩(wěn)定。3掃描電鏡下可見到三種形態(tài)的細(xì)胞:以寬大扁平形的細(xì)胞為主,長梭形和圓球形細(xì)胞占少數(shù)。細(xì)胞表面可見大量短而粗的微絨毛樣突起,推測這樣的結(jié)構(gòu)特征可能更有利于細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)交換。 二、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究 目的:體外定向誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。 方法:1按照第一部分的方法收集大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,分離、純化、培養(yǎng)、傳代。2分別取不同代數(shù)對數(shù)生長期的細(xì)胞,應(yīng)用二甲基亞砜(DMSO)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)對其進(jìn)行不同方式的誘導(dǎo)。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色及western blot的方法鑒定誘導(dǎo)后的細(xì)胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和神經(jīng)微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)的表達(dá)。 結(jié)果:對照組:細(xì)胞在預(yù)誘導(dǎo)和正式誘導(dǎo)過程中細(xì)胞形態(tài)均無明顯變化,免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示NSE為陰性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組:細(xì)胞在24h的預(yù)誘導(dǎo)中形態(tài)無明顯變化,正式誘導(dǎo)后1h細(xì)胞胞體開始向胞核收縮,呈圓形;3h后胞體圓形呈典型的核質(zhì)體形態(tài),并開始長出1-3個細(xì)胞突起;5h后突起不斷延長,出現(xiàn)2-3級突起并相互交錯;7h后胞體圓形,伸出的2-3級突起相互交織成網(wǎng)狀。其中含血清誘導(dǎo)組中細(xì)胞誘導(dǎo)5h開始有部分細(xì)胞漂浮死亡現(xiàn)象,而無血清誘導(dǎo)組則無此現(xiàn)象。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:未行預(yù)誘導(dǎo)的兩組中,培養(yǎng)基中有血清組與無血清組的誘導(dǎo)率分別為:71.857±7.08249%、72.597±6.98511%。應(yīng)用1%DMSO+10ng/ml bFGF+無血清L-DMEM預(yù)誘導(dǎo)24h,10ng/mlbFGF+10%DMSO+無血清L-DMEM正式誘導(dǎo)7 h的細(xì)胞NSE的表達(dá)率為86.67±5.5148%。GFAP和MAP-2在各時間點(diǎn)均表達(dá)陰性。western blot結(jié)果顯示誘導(dǎo)后細(xì)胞NSE在0h、3h、5h、7h的表達(dá)(與β-actin的比值)分別為0.232±0.00364、0.3141±0.00414、0.321±0.00186、0.4683±0.00447。 結(jié)論:1應(yīng)用1%DMSO+10ng/ml bFGF+無血清L-DMEM預(yù)誘導(dǎo)24h,10ng/mlbFGF+10%DMSO+無血清L-DMEM正式誘導(dǎo)7h可以誘導(dǎo)MSC分化成為神經(jīng)元樣細(xì)胞,并達(dá)到最大的誘導(dǎo)率86.67%。2應(yīng)用1%DMSO+10ng/ml bFGF+無血清L-DMEM預(yù)誘導(dǎo)24h,可顯著提高M(jìn)SC向神經(jīng)元樣細(xì)胞的誘導(dǎo)率。3誘導(dǎo)液中無血清可延長誘導(dǎo)后細(xì)胞的生存時間。 三、BrdU體外標(biāo)記大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究。 目的:探討連續(xù)培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用BrdU標(biāo)記的穩(wěn)定性、最佳階段、時間和劑量,從而達(dá)到應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行研究最好的示蹤目的。 方法:1按照第一部分的方法收集大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,分離、純化、培養(yǎng)、傳代。2取不同代數(shù)的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片,在細(xì)胞生長的不同時期、應(yīng)用不同濃度的BrdU標(biāo)記不同時間后,用免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法進(jìn)行鑒定。 結(jié)果:1對P2、P4、P6的MSC進(jìn)行BrdU標(biāo)記,其標(biāo)記率分別為94.868±3.739%、95.696±3.952%、94.774±3.565%。2對生長至第2、4、6天的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記,標(biāo)記率分別為60.286±6.197%、96.175±3.689%、65.017±5.982%。3對細(xì)胞標(biāo)記24h、48h、72h時,標(biāo)記率分別為58.895±10.025%、95.375±4.136%、94.835±2.970%。4分別應(yīng)用BrdU濃度為5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L標(biāo)記時,標(biāo)記率分別為47.192±5.459%、95.382±4.363%、95.993±3.344%。 結(jié)論:1應(yīng)用BrdU對不同代MSC進(jìn)行標(biāo)記效果穩(wěn)定。2選擇濃度為10μmol/L,對處于對數(shù)生長期的MSC標(biāo)記48h,可以達(dá)到最大的標(biāo)記率。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1435305