本文關(guān)鍵詞：河北省不同地區(qū)糧食赭曲霉毒素A污染情況及OA致細(xì)胞損傷作用的研究　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 赭曲霉毒素(Ochratoxins,OT)是由赭曲菌(Asperegillus alutacells)和純綠青霉(Penicillium viridicatum)產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物,包括七種結(jié)構(gòu)類似的化合物,其中以赭曲霉毒素A(Ochratoxin A, OA)為主,毒性也最大。OA的分子量為404,熔點(diǎn)169℃,為無(wú)色晶體,易溶于有機(jī)溶劑(三氯甲烷和甲醇)和稀碳酸氫鈉溶液,微溶于水。在紫外線照射下OA呈綠色熒光,最大吸收峰為333nm。該化合物相當(dāng)穩(wěn)定,一般的烹調(diào)和加工方法只有部分破壞。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,赭曲霉毒素A具有腎毒性、免疫毒性和致癌、致畸、致突變性。1993年國(guó)際癌癥研究中心將赭曲霉毒素A列為可能的人類致癌物。一些國(guó)家已報(bào)道了從人全血、血清及人奶中檢出赭曲霉毒素A。研究表明,糧食污染是人類赭曲霉毒素A暴露的主要途徑。研究分析糧食赭曲霉毒素A污染情況對(duì)保障食品衛(wèi)生和安全具有非常重要的意義。目前,國(guó)外文獻(xiàn)中已有不少糧食赭曲霉毒素A污染情況的分析檢測(cè)報(bào)道,不少國(guó)家和國(guó)際組織還根據(jù)赭曲霉毒素A的污染情況制定了人體赭曲霉毒素A攝入量的限制標(biāo)準(zhǔn)。迄今為止,國(guó)內(nèi)有關(guān)糧食中赭曲霉毒素A的污染情況報(bào)道較少。目前,有關(guān)糧谷中赭曲霉毒素A的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法(TCL)、酶免疫檢測(cè)法(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC)等。我國(guó)谷物和大豆中赭曲霉毒素A的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法是TCL法,屬于目測(cè)半定量法,最低檢出量為10μg/kg,不適用于糧谷中赭曲霉毒素A的準(zhǔn)確測(cè)定和居民赭曲霉毒素A的膳食攝入量的暴露評(píng)估研究。 為準(zhǔn)確分析我國(guó)糧食中OA的污染情況,進(jìn)一步探討OA污染的生物學(xué)意義,本研究對(duì)OA的檢測(cè)方法進(jìn)行了改進(jìn),建立了靈敏度高、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確可靠的OA高效液相色譜熒光定量檢測(cè)方法。對(duì)河北省不同地理環(huán)境的三個(gè)地區(qū)糧食中赭曲霉毒素A污染情況進(jìn)行了定量檢測(cè)。同時(shí),以細(xì)胞培養(yǎng)、FCM等方法研究了OA對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖和凋亡的影響,探討了OA對(duì)人正常腎小管上皮細(xì)胞株(HKC)和人肺泡II型上皮細(xì)胞(AT-II)細(xì)胞系A(chǔ)549凋亡的誘導(dǎo)作用。在上述工作的基礎(chǔ)上,采用Western Blotting和免疫組化方法等方法在蛋白水平上對(duì)JNK通路在OA誘導(dǎo)細(xì)胞損傷中作用及OA誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的機(jī)制進(jìn)行了研究。 本研究共分為五部分: 第一部分:赭曲霉毒素A檢測(cè)方法的建立目的:建立SPE - C_(18)柱純化和富集—高效液相色譜法熒光檢測(cè)糧谷和酒類樣品中赭曲霉毒素A的系列方法。 方法:1用三氯甲烷提取玉米、小麥和大麥樣品中的OA后,經(jīng)C_(18)固相萃取柱凈化處理,以乙腈:水:乙酸(99:99:2)作為流動(dòng)相,用帶有熒光檢測(cè)器的反相高效液相色譜法(激發(fā)波長(zhǎng)為333nm,發(fā)射波長(zhǎng)為460nm)檢測(cè)OA含量;2選用C_(18)固相萃取小柱(250mg/3ml),用2ml乙腈和2ml水分別活化C_(18)小柱,30ml酒樣通過(guò)C_(18)固相萃取小柱,控制流速30滴/分。再用2ml乙腈溶液洗脫,最后將C_(18)小柱抽干。45℃下氮?dú)獯蹈?流動(dòng)相溶液稀釋至0.5ml,0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后取20μL進(jìn)高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果:1.分別在小麥和大麥樣品中加入3種不同量的OA標(biāo)準(zhǔn)物。小麥加標(biāo)樣品的回收率為78.60%~92.73%,變異系數(shù)為1.46%~2.98%,大麥加標(biāo)樣品的回收率為77.61%~93.21%,變異系數(shù)為1.74%~3.45%;為考察該方法的準(zhǔn)確度,對(duì)北京中檢維康玉米加標(biāo)盲樣(OA濃度范圍介于5.33~9.91ng/g)進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果為6.75ng/g,在盲樣范圍內(nèi),經(jīng)t檢驗(yàn),在95%的置信水平上,測(cè)定平均值(n=3)與盲樣給定值無(wú)顯著性差異。2.本實(shí)驗(yàn)對(duì)干紅葡萄酒,白葡萄酒和紅葡萄酒分別進(jìn)行了0.25ng/ml、0.5ng/ml、1.5ng/ml三個(gè)濃度的加標(biāo)回收,對(duì)三種葡萄酒樣品,每個(gè)加標(biāo)水平平行3份,按上述方法提取測(cè)定,各種樣品的加標(biāo)回收率均在80.1~109.8%。平行三次測(cè)定加標(biāo)回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.5~5.2%之間。 第二部分:河北省不同地區(qū)糧食中赭曲霉毒素A污染情況研究 目的:分析河北省不同地理環(huán)境地區(qū)居民食用糧食OA污染情況,了解河北省居民OA的暴露量,揭示其對(duì)健康的可能影響,為減少OA污染及其影響奠定基礎(chǔ)。 方法:抽樣檢測(cè)河北省不同地理環(huán)境的三個(gè)代表性地區(qū)糧食OA污染情況,三個(gè)地區(qū)分別為河北省南部邯鄲市磁縣、河北省中部石家莊市贊皇縣和河北省北部塞外地區(qū)張家口市赤城縣。分別入戶采取中南部地區(qū)居民日常食用主糧小麥和北部地區(qū)居民日常食用主糧大麥樣品。采用反相—高效液相色譜法檢測(cè)OA含量:用三氯甲烷提取小麥和大麥樣品中的OA后,經(jīng)C18固相萃取柱凈化處理,以乙腈:水:乙酸(99:99:2)作為流動(dòng)相,用帶有熒光檢測(cè)器的高效液相色譜儀(激發(fā)波長(zhǎng)為333nm,發(fā)射波長(zhǎng)為460nm)檢測(cè)OA含量。 結(jié)果:大麥樣品OA經(jīng)反相—高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果表明,張家口市赤城縣31份大麥樣品中,11份樣品檢測(cè)到OA,污染率為35.48%,其平均含量為6.96μg/kg,最低者為0.21μg /kg,而最高可達(dá)35.36μg/kg;贊皇縣居民食用小麥樣品中赭曲霉毒素A的檢出率為45.16%,平均含量2.41μg/kg,最高達(dá)14.25μg/kg。河北省磁縣居民食用小麥中赭曲霉毒素A的檢出率為33.33%,平均含量0.59μg/kg,最高為1.63μg/kg。根據(jù)居民人均食用糧食重量計(jì)算,贊皇縣農(nóng)村居民OA的日暴露量為1.17μg/ kg,磁縣農(nóng)村居民OA的日暴露量為0.31μg/kg,張家口赤城農(nóng)村居民OA的日暴露量為3.38μg/kg,超過(guò)世界衛(wèi)生組織/糧農(nóng)組織聯(lián)合專家委員會(huì)暫定的容許攝入量。可見(jiàn)河北省不同地理環(huán)境居民食用糧食中OA的污染均比較普遍,應(yīng)當(dāng)引起有關(guān)部門的重視。 第三部分赭曲霉毒素A對(duì)體外培養(yǎng)HPBMCs增殖與凋亡的研究 目的:探討OA對(duì)體外培養(yǎng)HPBMCs增殖與凋亡的影響,揭示OA暴露對(duì)機(jī)體免疫功能的可能作用。 方法:健康獻(xiàn)血員抗凝靜脈血200mL,采用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法(ficoll-hypaque density gradient centrifug- ation)分離人外周靜脈血單個(gè)核細(xì)胞,接種于含10%胎牛血清,105U/L青霉素,100mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中,加入PHA并使其終濃度為300μg/mL,37℃、5%CO_2培養(yǎng)24h,更換不含PHA的新的培養(yǎng)液。HPBMCs隨機(jī)分為4組:空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、1μmol/L OA和5μmol/L OA實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組分別給予乙醇溶解的OA處理,使其終濃度分別為1μmol/L和5μmol/L,對(duì)照組和溶劑對(duì)照組分別給予等體積生理鹽水和乙醇處理。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h,常規(guī)收集細(xì)胞,采用流式細(xì)胞定量檢測(cè)術(shù)(FCM)檢測(cè)HPBMCs細(xì)胞凋亡率和增殖指數(shù),以及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)。 結(jié)果: FCM檢測(cè)結(jié)果表明, OA處理24h,1μmol/L OA和5μmol/L OA組HPBMCs細(xì)胞凋亡率分別為10.90±0.85%,16.03±0.37%,均高于對(duì)照組(8.17±1.45%,P0.05)。1μmol/L OA和5μmol/L OA組細(xì)胞增殖指數(shù)分別為35.77±4.74和36.89±7.63,與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性(33.53±1.97,P0.05),說(shuō)明OA處理24h可以促進(jìn)HPBMCs凋亡,但對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有影響。 FCM定量分析表明,OA作用24h后,1μmol/L OA和5μmol/L OA組HPBMCs細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)FI值明顯高于對(duì)照組(1.13±0.02和1.14±0.06 vs 1.00±0.04,P 0.05)。 第四部分:赭曲霉毒素A對(duì)A-549和HKC細(xì)胞損傷的研究 目的:探討OA處理對(duì)A549和HKC細(xì)胞增殖與凋亡的影響及可能機(jī)制,并觀察OA對(duì)體外分離的DNA致?lián)p傷作用。 方法:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549和HKC細(xì)胞,用10%DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度為(1~2)×10~8L~(-1),接種于細(xì)胞培養(yǎng)板和細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。細(xì)胞培養(yǎng)24h后,隨機(jī)分為4組:空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、1μmol/L OA和5μmol/L OA實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組分別給予OA 1μmol/L和5μmol/L處理,溶劑對(duì)照組和對(duì)照組分別給予DMSO(0.4mL·L~(-1))和生理鹽水處理,繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)24h。采用MTT法檢測(cè)A549和HKC細(xì)胞存活率。采用FCM檢測(cè)A549和HKC細(xì)胞凋亡率,以及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)表達(dá)情況;采用紫外以及熒光光譜法檢測(cè)了OA與小牛胸腺和鮭魚(yú)精DNA的相互作用形成的DNA加合物。 結(jié)果:MTT檢測(cè)結(jié)果表明,OA對(duì)A549和HKC細(xì)胞的生長(zhǎng)均有一定抑制作用:1μM、5μM OA作用不同時(shí)間后,兩株細(xì)胞存活率均較相應(yīng)對(duì)照組降低,尤以24h更明顯(P0.05)。1μM、5μM OA處理24h后,A549細(xì)胞存活率分別為80.71%和70.85%,明顯低于對(duì)照組(100%,P0.05);HKC細(xì)胞存活率分別為51.09%和54.69%,也低于對(duì)照組(100%,P0.05)。提示OA對(duì)A549和HKC細(xì)胞具有明顯的致?lián)p傷作用。 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果表明,A549細(xì)胞經(jīng)1μM、5μM OA處理24h后,OA處理細(xì)胞凋亡率明顯升高,5μM OA處理組凋亡率為2.68±0.55%,明顯高于對(duì)照組(1.53±0.23%,P0.05)。HKC細(xì)胞經(jīng)OA處理24h后,1μM和5μM OA組細(xì)胞凋亡率分別為3.85±0.29%和4.86±0.51%,均明顯高于對(duì)照組(1.23±0.05%,P0.05)。表明OA對(duì)A549和HKC細(xì)胞具有明顯的促凋亡作用。 FCM檢測(cè)組方圖及定量分析表明,OA作用24h后,A549和HKC細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組。 紫外光譜法分析結(jié)果顯示DNA與OA沒(méi)有發(fā)生相互作用;熒光光譜法分析結(jié)果顯示OA沒(méi)有與DNA相結(jié)合。 第五部分:JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在赭曲霉毒素A誘導(dǎo)HKC凋亡中的作用 目的:探討JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在赭曲霉毒素A誘導(dǎo)HKC凋亡中的作用,以期進(jìn)一步探討OA誘導(dǎo)凋亡的可能機(jī)制。 方法: 5.1 OA對(duì)HKC細(xì)胞JNK激酶活性和Caspase-3蛋白表達(dá)影響的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分組與處理同論文第四部分有關(guān)OA作用HKC細(xì)胞24h的實(shí)驗(yàn)分組和處理。細(xì)胞處理24h后,離心收細(xì)胞用于相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法和Western blot方法檢測(cè)HKC細(xì)胞p-JNK水平,JNK和Caspase-3蛋白表達(dá)。 5.2 JNK抑制劑SP600125預(yù)處理對(duì)OA誘導(dǎo)HKC細(xì)胞JNK激酶活性、凋亡率、Caspase-3蛋白表達(dá)和細(xì)胞損傷影響的檢測(cè) 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞(傳代24h后),隨機(jī)分為空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、OA處理組和JNK阻斷劑組。1μM OA處理組給予終濃度為1μM OA;JNK阻斷劑組預(yù)先加入0.5μM SP600125孵育30min后再加入1μM OA ;空白對(duì)照組加入生理鹽水;溶劑對(duì)照組加入乙醇(1:500)+DMSO(1:30000)。細(xì)胞培養(yǎng)24h后消化離心收集細(xì)胞。采用Western blot方法檢測(cè)HKC細(xì)胞p-JNK水平;采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和Caspase-3蛋白表達(dá);采用MTT比色法檢測(cè)HKC細(xì)胞的存活率。 結(jié)果 5.1OA對(duì)HKC細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 免疫細(xì)胞化學(xué)染色,光鏡下觀察可見(jiàn)Caspase-3蛋白免疫陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色顆粒狀,定位于HKC細(xì)胞胞漿內(nèi)。1μMOA、5μM OA處理組HKC細(xì)胞Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞比率分別為54.03±9.21%,60.75±9.95%,明顯高于對(duì)照組(14.31±4.24%,P0.05)。 Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),給予不同劑量OA處理后,細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組,進(jìn)一步證實(shí)給予OA處理可以促進(jìn)體外培養(yǎng)HKC細(xì)胞Caspase-3蛋白的表達(dá)。 5.2OA對(duì)HKC細(xì)胞p-JNK水平的影響 免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見(jiàn)p-JNK陽(yáng)性染色為棕黃色顆粒,定位于HKC細(xì)胞胞漿及胞核內(nèi)。1μMOA和5μMOA處理組HKC細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞比率分別為53.31±11.01%和58.53±11.11% ,明顯高于對(duì)照組(10.19±6.85%,P0.05)。Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),給予不同劑量OA處理后,HKC細(xì)胞p-JNK水平明顯高于對(duì)照組(P0.05),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,給予OA處理可以提高體外培養(yǎng)HKC細(xì)胞JNK磷酸化水平。 5.3OA對(duì)HKC細(xì)胞JNK蛋白表達(dá)的影響 免疫細(xì)胞化學(xué)方法和Western blot結(jié)果顯示OA對(duì)HKC細(xì)胞JNK蛋白表達(dá)沒(méi)有影響。 5.4 SP600125預(yù)處理對(duì)OA作用后HKC細(xì)胞p-JNK激酶活性的影響 免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見(jiàn),JNK阻斷劑組HKC細(xì)胞p-JNK激酶陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞比率為15.51±3.35%,明顯低于1μM OA處理組(53.28±7.08%,P0.05,)。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),給予SP600125預(yù)處理HKC細(xì)胞p-JNK水平明顯降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,給予SP600125預(yù)處理可以降低HKC細(xì)胞p-JNK的表達(dá),進(jìn)一步說(shuō)明OA處理可以激活JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 5.5SP600125預(yù)處理對(duì)OA作用后HKC細(xì)胞凋亡率的影響 FCM細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果表明, HKC細(xì)胞經(jīng)SP600125預(yù)處理30min后,JNK阻斷劑組+OA組細(xì)胞凋亡率為2.44±0.38%,低于單純OA處理組(4.24±0.38%, P0.05),但高于空白對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率1.06±0.14%(P0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SP600125預(yù)處理可以部分抑制體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞HKC的凋亡。 5.6 SP600125預(yù)處理對(duì)OA作用后HKC細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白 Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見(jiàn),JNK阻斷劑組Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞比率為31.42±4.67%,較1μMOA處理組明顯降低(55.86±6.51%,P0.05),但高于對(duì)照組(13.97±1.59%,P0.05)。Western blot檢測(cè)結(jié)果證實(shí)給予SP600125預(yù)處理可以部分降低OA引起的HKC細(xì)胞Caspase-3蛋白的表達(dá)。推測(cè)OA給予SP600125預(yù)處理可以部分降低OA引起的HKC細(xì)胞Caspase-3蛋白的表達(dá)。OA通過(guò)激活JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路部分介導(dǎo)caspase-3蛋白活化。 5.7SP600125預(yù)處理對(duì)OA作用后HKC細(xì)胞存活率的影響 MTT檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)給予特異性JNK阻斷劑-SP600125預(yù)處理后,JNK阻斷劑+OA組HKC細(xì)胞的存活率為82.09%,明顯高于單獨(dú)OA處理組(66.83%,P0.05);但是低于溶劑對(duì)照組(98.58%,P0.05),說(shuō)明SP600125對(duì)OA致HKC細(xì)胞損傷具有部分阻斷作用,OA通過(guò)JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與介導(dǎo)細(xì)胞死亡。 結(jié)論: 1.建立了反相—高效液相色譜法檢測(cè)糧谷和酒類樣品中赭曲霉毒素A的系列方法,本方法具有準(zhǔn)確度高、精密度好和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。可定量檢測(cè)糧谷和酒類樣品中赭曲霉毒素A,檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠,提取凈化過(guò)程簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),為食品中赭曲霉毒素A污染情況調(diào)查和居民對(duì)赭曲霉毒素A的暴露評(píng)估提供了有力的技術(shù)支持和保障。 2.通過(guò)對(duì)河北省不同地區(qū)居民食用主糧調(diào)查發(fā)現(xiàn):河北省中南部地區(qū)居民食用小麥中OA的檢出率達(dá)39.34%,北部地區(qū)居民食用的大麥中OA的檢出率達(dá)到35.48%,均明顯高于國(guó)內(nèi)已有的研究報(bào)道。贊皇縣農(nóng)村居民OA的日暴露量為1.17μg/ kg,磁縣農(nóng)村居民OA的日暴露量為0.31μg/ kg,張家口赤城農(nóng)村居民OA的日暴露量為3.38μg/ kg,超過(guò)世界衛(wèi)生組織/糧農(nóng)組織聯(lián)合專家委員會(huì)暫定的容許攝入量�？梢�(jiàn)河北省不同地理環(huán)境居民食用糧食中OA的污染均比較普遍,應(yīng)當(dāng)引起重視。 3. OA可以促進(jìn)體外培養(yǎng)HPBMCs凋亡,上調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá),但對(duì)HPBMCs增殖沒(méi)有明顯影響。 4. OA可抑制體外培養(yǎng)A549和HKC細(xì)胞增殖,上調(diào)Caspase-3蛋白的表達(dá),促進(jìn)體外培養(yǎng)A549和HKC細(xì)胞凋亡。OA可能對(duì)體外分離的DNA沒(méi)有損傷作用。 5. OA可以提高體外培養(yǎng)HKC細(xì)胞p-JNK水平,激活JNK途徑。 6. JNK抑制劑SP600125預(yù)處理降低OA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、Caspase-3蛋白上調(diào)及細(xì)胞損傷作用,提示JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路部分參與OA介導(dǎo)細(xì)胞損傷和凋亡過(guò)程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R363

【引證文獻(xiàn)】

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1 楊蕾;中藥中赭曲霉毒素A的檢測(cè)方法研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2010年

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本文編號(hào)：1416813