本文關(guān)鍵詞：淡色庫(kù)蚊轉(zhuǎn)鐵蛋白在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及其抑菌活性的初步研究　出處：《中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志》2014年01期 　論文類型：期刊論文

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【摘要】：目的利用畢赤酵母(Pichia pastoris)分泌表達(dá)具有生物活性的淡色庫(kù)蚊(Culex pipiens pallens)轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin,Tsf),并初步研究其抑菌活性。方法 RT-PCR擴(kuò)增淡色庫(kù)蚊轉(zhuǎn)鐵蛋白的編碼基因序列,并克隆至畢赤酵母組成型表達(dá)載體pGAPZα-A的α-factor信號(hào)肽序列下游,構(gòu)建pGAPZα-A-Tsf重組分泌表達(dá)載體。重組載體經(jīng)XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切和測(cè)序正確后,采用BlnⅠ線性化處理,電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化子經(jīng)Zeocin抗性篩選和菌落PCR構(gòu)建pGAPZα-A-Tsf/GS115工程菌。重組轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)上清采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)分析。表達(dá)上清經(jīng)鎳-氨三乙酸親和層析柱(NiNTA)純化后,磷酸緩沖液(PBS)稀釋為1.000、0.500、0.250和0.125 mg/ml,采用瓊脂糖擴(kuò)散抑菌圈法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 RT-PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)鐵蛋白基因片段大小為2 100 bp,與預(yù)期結(jié)果一致。pGAPZα-A-Tsf重組載體雙酶切獲得2 127 bp條帶,與預(yù)期結(jié)果一致,測(cè)序結(jié)果表明其構(gòu)建成功。菌落PCR結(jié)果顯示,pGAPZα-A-Tsf/GS115工程菌構(gòu)建成功。SDS-PAGE和Western blotting結(jié)果顯示,重組轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)了相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約為80 200的蛋白產(chǎn)物,與預(yù)期大小一致。Ni-NTA純化后重組轉(zhuǎn)鐵蛋白的抑菌實(shí)驗(yàn)表明,添加1.000、0.500、0.250 mg/ml重組轉(zhuǎn)鐵蛋白的平板上均有明顯的抑菌圈,最低抑菌濃度為0.250 mg/ml。結(jié)論淡色庫(kù)蚊轉(zhuǎn)鐵蛋白可通過基因重組方式從畢赤酵母中分泌表達(dá)具有抑菌活性的轉(zhuǎn)鐵蛋白。
[Abstract]:The purpose of using Pichia yeast (Pichia pastoris) expression with biological activity of Culex pipiens pallens (Culex pipiens pallens) transferrin (Transferrin, Tsf), and study its antibacterial activity. Encoding gene sequence was amplified by RT-PCR transferrin of Culex pipiens pallens, alpha -factor downstream signal peptide sequence and cloned into Pichia pastoris expression vector pGAPZ alpha -A, alpha pGAPZ construct -A-Tsf recombinant expression vector. The recombinant vector by Xho I and Xba I double enzyme digestion and sequencing, the Bln of linear processing, electroporation of Pichia pastoris GS115 by normal cells, transformants by Zeocin resistance screening and colony PCR to construct pGAPZ alpha -A-Tsf/GS115. The recombinant engineering bacteria the expression of transferrin supernatant using twelve sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blot analysis (Western blotting). The supernatant by nickel ammonia acetic acid Pro three And column (NiNTA) after purification, phosphate buffer (PBS) diluted to 1.000,0.500,0.250 and 0.125 mg/ml by agar diffusion method antibacterial bacteriostatic ring experiment. Results the results of RT-PCR showed that the transferrin gene fragment size was 2100 BP, consistent with the expected results of.PGAPZ alpha -A-Tsf recombinant vector digested 2127 BP bands, and the expected results, the results of sequencing showed that the constructed colony. PCR results showed that the pGAPZ alpha -A-Tsf/GS115 engineering bacteria were successfully constructed..SDS-PAGE and Western blotting results showed that the recombinant expression of transferrin relative molecular weight (Mr) of about 80200 protein products, showed that the Bacteriostatic Experiment of transferrin was consistent with the expected size of purified recombinant.Ni-NTA, adding 1.000,0.500,0.250 tablet mg/ml recombinant transferrin have obvious bacteriostatic ring, minimum inhibitory concentration was 0.250 mg/ml. conclusion Culex pipiens pallens transferrin Transferrin can be secreted from Pichia pastoris by gene recombination.

【作者單位】： 麗水學(xué)院醫(yī)學(xué)院;杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院;
【分類號(hào)】：R384.1;Q966
【正文快照】： 轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)是血漿中主要的含鐵蛋白質(zhì),負(fù)責(zé)運(yùn)載由消化管吸收的鐵和由紅細(xì)胞降解釋放的鐵,廣泛存在于無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物體內(nèi),不同種屬和組織之間轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量差別很大[1]。轉(zhuǎn)鐵蛋白作為參與機(jī)體生理基礎(chǔ)代謝活動(dòng)的鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在結(jié)構(gòu)上具有一定的保守性,其

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本文編號(hào)：1406694