發(fā)布時(shí)間：2018-01-02 18:33

  本文關(guān)鍵詞：腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）基因的改造及其在畢赤氏酵母菌中的表達(dá)分析　出處：《華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)》2005年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis inducing ligand, TRAIL)是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)基因超家族眾多成員之一,能通過(guò)死亡受體的參與而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 TRAIL與腫瘤細(xì)胞膜表面特殊的復(fù)雜的受體系統(tǒng)(兩個(gè)死亡受體和三個(gè)誘騙受體)相互作用。由于它的三聚體形式能誘導(dǎo)許多轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡卻不會(huì)殺傷正常細(xì)胞的特性而有望成為極有潛力的治療腫瘤的藥物,引起研究者極大的興趣。 本研究利用甲醇畢赤氏酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)TRAIL基因進(jìn)行了表達(dá)研究和高效表達(dá)菌株的篩選。以pGEM-TRAIL為模板,設(shè)計(jì)了三對(duì)引物P1、P2、P3、P4、P5、P6,利用套疊PCR技術(shù)成功地獲得了含有KEX2位點(diǎn)和ATTTA位點(diǎn)以及同時(shí)含有這兩個(gè)突變位點(diǎn)的可溶性TRAIL基因片段,并成功地克隆到E.coli DH5α中擴(kuò)增。 將改造后的TRAIL基因連接到甲醇畢赤酵母Pichia pastoris的YIP型表達(dá)載體上,通過(guò)Zeocin抗生素篩選,Xba Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切鑒定,獲得重組表達(dá)載體pPICZ_α-A-TRAIL_(unmodified)、pPICZ_α-A-TRAIL_(KEX2 mutation)、pPICZ_α-A-TRAIL_(ATTTA mutation)、pPICZ_α-A-TRAIL_(KA double mutation)。 利用電轉(zhuǎn)化技術(shù)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,經(jīng)Zeocin抗生素篩選、PCR檢測(cè)獲得陽(yáng)性的酵母工程菌株pPICZ_α-A-TRAIL_(unmodified)/GS115、pPICZ_α-A-TRAIL_(KEX2 mutation)/GS115、pPICZ_α-A-TRAIL_(ATTTA mutation)/GS115、pPICZ_α-A-TRAIL_(KA double mutation)/GS115。 搖瓶培養(yǎng)確定畢赤酵母工程菌搖瓶最適pH值為5.5-6.5;最佳甲醇誘導(dǎo)濃度為1%;最適誘導(dǎo)周期為96 h。 利用SDS-PAGE進(jìn)行高表達(dá)菌株的篩選,得到高表達(dá)菌株,表達(dá)水平分別達(dá)到71.5 mg/L(對(duì)照)、127.5 mg/L、114 mg/L和183 mg/L,這說(shuō)明改造后的菌株表達(dá)量比未突變的菌株表達(dá)量有較明顯的提高。 利用CM-柱層析對(duì)重組蛋白進(jìn)行了初步純化研究。用Western blot檢測(cè)表明重組蛋白具有TRAIL抗原活性。MTT法檢測(cè)表達(dá)菌株發(fā)酵產(chǎn)物顯示重組蛋白具有生物活性。
[Abstract]:TNF - related apoptosis inducing ligand ( TRAIL ) associated with tumor necrosis factor is one of the many members of tumor necrosis factor ( TNF ) gene superfamily , which can induce apoptosis by the involvement of death receptor . TRAIL interacts with a specific complex receptor system ( two death receptors and three decoy receptors ) on the surface of the tumor cell membrane . Because of its trimer form , it is expected that many transformed cells will not kill normal cells but are expected to be extremely potential drugs for the treatment of tumors , causing great interest in the researchers . Three pairs of primers P1 , P2 , P3 , P4 , P5 and P6 were designed by using Pichia pastoris expression system . Three pairs of primers P1 , P2 , P3 , P4 , P5 and P6 were designed . The modified TRAIL gene was ligated to YIP expression vector of Pichia pastoris , and was screened by Zeocin antibiotic and Xba I / Xho I double digestion . The recombinant expression vector pZ偽 - A - TRAIL _ ( inducer ) , ZZ _ 偽 - A - TRAIL _ ( ATTTA mutation ) and ZZ _ 偽 - A - TRAIL _ ( KA double mutation ) were obtained . The recombinant expression vector was transformed into Pichia pastoris GS115 by electroporation . After Zeocin antibiotic screening , the positive yeast engineering strains were screened by PCR . The positive yeast engineering strains were identified by PCR . The positive yeast strains were GS115 , ZZ _ 偽 - A - TRAIL _ ( KEX2 mutation ) / GS115 , ZZ _ 偽 - A - TRAIL _ ( ATTTA mutation ) / GS115 , ZZ _ 偽 - A - TRAIL _ ( KA double mutation ) / GS115 . pPICZ_偽-A-TRAIL_(KEX2 mutation)/GS115,pPICZ_偽-A-T High - expression strains were screened by SDS - PAGE . The expression levels of the strains were 71.5 mg / L ( control ) , 127.5 mg / L , 114 mg / L and 183 mg / L , respectively . The recombinant protein was purified by CM - column chromatography . Western blot was used to detect the activity of recombinant protein .

【學(xué)位授予單位】：華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：1370435