本文關(guān)鍵詞：HpaA-VacA IgY體內(nèi)抗H.pylori感染及生物利用度的研究　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 目的:用pQE30-HpaA-VacA-DH5a菌大量表達(dá)幽門螺桿菌(Helicobfacter pylori H.pylori)黏附素(HpaA)與細(xì)胞空泡毒素(VacA)的重組蛋白HpaA-VacA,以此重組蛋白為抗原,制備高效價的幽門螺桿菌重組蛋白卵黃抗體(HpaA VacA IgY)。 方法: 1、大量培養(yǎng)重組菌pQE30-HpaA-VacA-DH5a,誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白HpaA-VacA,SDS-PAGE分析其表達(dá)形式,經(jīng)Ni2+-NTA樹脂純化后,Bradford法測定蛋白濃度,ELISA法鑒定其免疫原性。 2、用純化的重組蛋白免疫產(chǎn)蛋母雞,制備HpaA-VacA IgY,建立檢測HpaA-VacA IgY的ELISA法,測定其效價;將高效價的IgY混合,飽和硫酸銨法純化后,SDS-PAGE測定純度,Bradford法測定蛋白含量,ELISA法鑒定IgY的特異性。 結(jié)果: 1.SDS-PAGE電泳顯示目的蛋白相對分子量為65000,主要以包涵體形式表達(dá),經(jīng)NI2+-NTA柱純化后,純度達(dá)90%以上,Bradford法測得蛋白質(zhì)含量為1.2mg/ml。 2.免疫原性鑒定結(jié)果顯示重組蛋白HpaA VacA分別具有HpaA和VacA的抗原特異性 3.獲得的HpaA VacA IgY經(jīng)濃縮純化后,效價為1:12800,蛋白濃度為19mg/ml,并同時具有針對HpaA和VacA抗原結(jié)合的特異性,效價分別為6400和3200。 結(jié)論:成功地獲得了較高濃度和純度的重組蛋白HpaA-VacA,并制備了高濃度、較高效價的特異性HpaA-VacA IgY,該IgY同時具有針對HpaA和VacA抗原結(jié)合的特異性。 第二部分HpaA-VacA IgY體內(nèi)抗H.pylori感染的研究 目的:通過給Balb/c小鼠口服HpaA-VacA IgY,觀察防治H.pylori感染的效果,找出其預(yù)防和治療H.pylori感染的最低濃度,以評價其防治H.pylori感染的可行性,為制備集治療和預(yù)防為一體的抗H.pylori感染的的雙效性制劑奠定基礎(chǔ)。 方法:將Balb/c小鼠隨機(jī)分成四組:陽性對照組(H.pylori感染組)、陰性對照組、治療組和預(yù)防組,按HpaA-VacA IgY劑量不同將治療組和預(yù)防組再分別分為六組即PBS對照,1,2,4,6,和8mg/ml組。陽性對照組:分3次給小鼠灌喂H.pylori,每次間隔1天,于末次灌喂4周,8周和12周分別處死小鼠,檢測感染情況;陰性對照組:用布氏肉湯代替H.pylori用與陽性對照組相同的方法給小鼠灌喂;治療組:感染H.pylori的方法同陽性對照組,4周后給小鼠灌喂HpaA-VacA IgY,每次間隔1天,共3次,隔8周后處死小鼠,檢測感染情況和炎癥反應(yīng)情況;預(yù)防組:給小鼠灌喂HpaA-VacA IgY,半小時后再給小鼠灌喂H.pylori,每次間隔1天,共3次,于末次灌喂12周后處死小鼠,檢測H.pylori感染情況,計算預(yù)防率。以快速尿酶試驗,小鼠胃黏膜細(xì)菌培養(yǎng),胃黏膜組織切片姬姆薩染色鏡檢判定H.pylori感染,胃黏膜組織HE染色判定胃黏膜炎癥。 結(jié)果:H.pylori感染組的總感染率為70.4%,HpaA-VacA IgY劑量為6mg/ml時可以達(dá)到效理想的預(yù)防效果,8mg/ml時可以達(dá)到效理想的治療效果。 結(jié)論:成功地建立了H.pylori感染的Balb/c小鼠模型,口服抗體制劑HpaA VacA IgY對小鼠H.pylori感染有預(yù)防和治療雙重作用,為制備集預(yù)防和治療于一體的抗H.pylori感染的雙效性制劑奠定基礎(chǔ)。 第三部分: HpaA-VacA IgY生物利用度的初步探討 目的: ELISA法檢測不同酸性條件下含有不同種類糖的HpaA-VacA IgY的抗體活性,探討糖類在酸性環(huán)境下對IgY的保護(hù)作用;測定不同時間HpaA-VacA IgY在胃內(nèi)的滯留量和抗體活性,在胃粘膜表面的抗體活性。為評價特異性IgY防治H.pylori感染的生物利用度,尋找提高HpaA-VacA IgY生物利用度的途徑奠定基礎(chǔ)。 方法: 1、在HpaA-VacA IgY中分別加入菊糖,山梨醇,葡萄糖,蔗糖,葡聚糖,分別置于PH 1.0,2.0,3.0條件下37℃維持2h后,ELISA法檢測IgY的抗體活性,以評價糖在酸性條件下對IgY的保護(hù)作用。 2、在HpaA-VacA IgY中分別加入不同含量(10%,15%,20%,25%,30%,40%,50%)的山梨醇和菊糖,置于PH 2.0條件下37℃維持2h后,ELISA法檢測IgY的抗體活性,以評價山梨醇和菊糖在酸性條件下對IgY的保護(hù)作用。 3、將HpaA-VacA IgY灌胃家兔,間隔一定時間抽出胃內(nèi)液體,測量體積,測定PH值, ELISA法檢測抗體活性,取胃竇和胃體部的黏膜,ELISA法檢測抗體活性,以評價IgY的胃內(nèi)滯留量和抗體活性。 結(jié)果: 1.在酸性條件下,多種糖對HpaA-VacA IgY抗體活性均有一定的保護(hù)作用,其中山梨醇的作用最強(qiáng),菊糖其次。 2.PH=2.0時, 40%山梨醇30%菊糖對IgY的保護(hù)作用最強(qiáng)。 3.在給家兔灌喂后1h、4h和7.5h,HpaA-VacA IgY在胃腔內(nèi)的滯留量分別為注入量的68.8%、46%和14%。 4.在給家兔灌喂后40min,4h,7.5h,HpaA-VacA IgY的抗體活性分別為原來的68.8%、47.6%和29.1%。 5.注入HpaA-VacA IgY后,家兔胃內(nèi)的PH值在5.0-7.0之間波動,在3h時PH值最低(5.0)。 6.在胃竇和胃體黏膜均未檢測到HpaA-VacA IgY的抗體活性。 結(jié)論: 1、在酸性條件下,各種糖對HpaA-VacA IgY均有一定的保護(hù)作用,其中山梨醇和菊糖的保護(hù)作用最強(qiáng);在PH2.0條件下,40%山梨醇30%菊糖對IgY的保護(hù)作用最強(qiáng)。 2、HpaA-VacA IgY在家兔胃內(nèi)不同時間有不同的的滯留量,但滯留時間約為7.5h;隨時間的推移,HpaA-VacA IgY抗體活性逐漸下降,到7.5h時為原來的29.1%,胃竇和胃體黏膜未測出IgY活性;注入HpaA-VacA IgY后,胃內(nèi)PH值在5.0-7.0之間波動,最低為5.0。 3、本實驗為評價特異性HpaA-VacA IgY防治H.pylori感染的生物利用度,尋找提高IgY生物利用度的途徑奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1365706