本文關鍵詞：重組人白蛋白融合干擾素在畢赤酵母中的表達及穩(wěn)定性研究　出處：《安徽醫(yī)科大學》2006年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 電轉化 白蛋白融合α-2b干擾素 Mut表型 Wish細胞-VSV病毒系統(tǒng) 酶聯(lián)免疫吸附法

【摘要】：目的 用電轉化方法將線性化重組表達載體質粒pPIC9K-HSA-IFNα-2b轉化整合入畢赤酵母宿主菌SMD1168，甲醇誘導表達出具有生物活性的目的蛋白，并對轉化子表達條件及遺傳穩(wěn)定性進行初步研究。方法 提取重組表達質粒pPIC9K-HSA-IFNα-2b，小量限制性內切酶雙酶切鑒定，鑒定后的重組質粒進行限制性內切酶Sal Ⅰ酶切線性化，純化經(jīng)單酶切線性化的重組表達質粒DNA并電轉化巴斯德畢赤酵母菌(P．Pastoris)SMD1168。將陽性轉化子進行PCR鑒定和Mut表型鑒定并用甲醇誘導表達，將表達上清進行Western-Blot鑒定，抗G418抗性鑒定及用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定融合干擾素的表達水平。Wish細胞-VSV病毒系統(tǒng)的細胞病變抑制法(CPE)測定表達蛋白的抗病毒活性及其效價。在搖瓶培養(yǎng)條件下，初步研究了甲醇誘導濃度及菌體誘導起始OD_(600)值兩因素對轉化子表達水平的影響。最后，對轉化子基因及表達水平的遺傳穩(wěn)定性進行鑒定。結果 通過電轉化方法成功將酶切線性化重組表達質粒DNA整合入宿主菌基因組，并在甲醇誘導條件下成功表達出具有生物學活性的目的蛋白。用酶聯(lián)免疫法(ELISA)及Wish細胞-VSV病毒系統(tǒng)對目的蛋白的表達水平及抗病毒活性進行了測定，表達量和比活分別是300mg／L和1.1×10~7IU／mg。搖瓶條件下，通過對甲醇誘導濃度及誘導起始OD_(600)值兩因素對轉化子表達水平的影響的初步研究，我們發(fā)現(xiàn)：在0.5％～4.0％的范圍，隨著甲醇誘導濃度的升高蛋白表達量也升高，在其他因素固定時，菌體誘導起始OD值在5～80的范圍內，，隨著OD值的升高表達量反而下降。同時，整合入轉化子的基因還具有遺傳穩(wěn)定性。結論 酶切線性化重組表達質粒DNA的成功整合入宿主菌基因組及目的蛋白的成功表達和基因的表達遺傳穩(wěn)定性研究為大規(guī)模的發(fā)酵罐表達提供了保證。搖瓶條件下對轉化子表達水平影響因素的研
[Abstract]:Objective to integrate the linearized recombinant expression vector pPIC9K-HSA-IFN 偽 -2b into Pichia pastoris SMD1168 by electroporation. Methanol induced expression of bioactive target protein. Methods Recombinant expression plasmid pPIC9K-HSA-IFN 偽 -2b was extracted and identified by restriction enzyme digestion. The identified recombinant plasmid was linearized by restriction endonuclease Sal 鈪

本文編號：1364414