本文關鍵詞：PRAK相互作用蛋白的酵母雙雜交篩選及DJ-1與PRAK相互作用的研究　出處：《第一軍醫(yī)大學》2006年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： p38絲裂原蛋白激活激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一種應激激活的絲／蘇氨酸蛋白激酶，屬于MAPK超家族；目前已發(fā)現(xiàn)p38 MAPK家族成員有p38α、p38β、p38γ、p38δ，分子量約38～40 kD。各個亞型之間的不同功能部分與它們在不同組織的表達，激活方式以及底物特異性相關，不同的p38能被細胞應激(紫外線輻射、滲透性休克、熱休克、脂多糖、蛋白合成抑制劑)、某些細胞因子如IL-1、TNF-α等激活。 細胞應激或細胞表面受體與配體的結合介導p38的激活是一種由特定的激酶通過一種高度保守的三級激酶模式(MKKK／MKK／MAPK)而激活的過程。p38是在蘇氨酸(threonine，Thr)-甘氨酸(glycine，Gly)-酪氨酸(tyrosine，Tyr)活化基團中Thr和Tyr雙位點上被磷酸化而激活。能磷酸化激活p38的蛋白激酶有絲裂原激活蛋白激酶激酶3(mitogen-activated protein kinase kinase 3，MKK3)和MKK6。這兩種MKK都能被轉化生長因子β激活激酶1(transforming growthfactor-β-activated kinase 1，TAK1)、凋亡信號通路調控激酶1(apoptosissignal-regulating kinase 1，ASK1)、含SH3結構域富含脯氨酸的蛋白激酶(Srchomology domain 3-containing proline-rich protein kinase，SPRK)、p21激活激酶(p21-activated kinase，PAK)等激活。 p38被激活后將磷酸化一些特異性底物，包括多種轉錄因子，如轉錄激活因子2(activating transcription factor 2，ATF2)、C／EBP-β和C／EBP同源蛋白10(C／EBPbetaand C／EBP-homologous protein 10，CHOP10)、肌細胞結合增強因子2C(myocyteenhancer binding factor-2C，MEF2C)、Myc相關因子x(Myc-associated factor X，Max)，蛋白激酶，如MAPK激活蛋白激酶2(mitogen-activated protein kinase-activatcd protein kinase 2，MAPKAPK2)和MAPKAPK3、p38調控激活蛋白激酶(p38-regulated／activated protein kinase，PRAK)、MAPK作用激酶1(MAP kinase integrating kinase,，MNK1)和MNK2等。 由于p38能磷酸化許多不同的底物，因而有理由認為p38具有許多不同的生物學功能。p38 MAPK的激活涉及到細胞生長、細胞周期、細胞凋亡等過程。同時，也涉及到炎癥和應激反應的調控、轉錄因子的調控、細胞骨架重組等，在多種疾病過程都發(fā)揮重要作用，如在心肌肥大、缺血／再灌注損傷、神經(jīng)元病理、感染性疾病、創(chuàng)傷愈合和組織重塑中等。 PRAK是一個受p38調控的絲氨酸／蘇氨酸激酶，由471個氨基酸組成，分子量約54 kD；有關PRAK的功能研究目前存在著一些爭議，一些研究認為在細胞應激和致炎因子的刺激下，細胞中的PRAK能被p38磷酸化激活，被激活的PRAK轉而磷酸化激活小分子量熱休克蛋白27(heat shock protein 27，HSP27)，從而介導細胞骨架重構，參與細胞應激反應。但近年來，另一些研究發(fā)現(xiàn)PRAK能夠被非典型的MAPK家族成員ERK3磷酸化激活，而p38α／β對PRAK的磷酸化激活只有當p38和PRAK都在哺乳動物細胞中過度表達時才會發(fā)生。這一結果提示，PRAK在體內可能參與了ERK3信號傳導通路，而在正常生理狀況下p38可能并不是PRAK的上游調控激酶。另外，有關HSP27是否是PRAK的底物，目前也存在著爭議，有研究發(fā)現(xiàn)重組的GST-PRAK在體外雖然能被p38激活并磷酸化HSP27，但通過免疫共沉淀得到的內源性PRAK在體外并不能磷酸化HSP27。在受到NaAsO_2刺激的野生型和PRAK缺陷型細胞中，都能檢測到相近程度的HSP27的激活，提示HSP27在細胞內的激活可能并不完全受PRAK的調控。因此HSP27是否是PRAK的底物以及PRAK的底物到底有那些蛋白還需要進一步的研究證實。內源性PRAK主要定位于胞質中；而外源性表達的PRAK則主要位于細胞核中。序列分析表明，PRAK同時含有一個核輸出信號(nuclaer export sequence，NES)和一個核定位信號(nuclear localization sequence，NLS)，而這兩者對于PRAK的穿梭而言是必不可少的。在受到刺激后，由于PRAK入核減少而出核增加，導致核中的PRAK減少。PRAK的入核不依賴于p38的激活，但出核則依賴于p38對其磷酸化。因而，PRAK的亞細胞分布由多種因素決定，而且PRAK在胞質與胞核之間的穿梭到底介導哪些細胞功能也不清楚。 可以看出，p38 MAPK信號通路具有廣泛和復雜的生物學功能，PRAK作為該通路中的重要成員一直是研究的熱點。但目前我們對其認識還十分有限，并且在許多問題上還存在著一些爭議。為了進一步研究PRAK的功能，及其可能的下游底物和上游激酶，我們利用酵母雙雜交篩選系統(tǒng)篩選了與PRAK相結合的蛋白。 酵母雙雜交是研究蛋白質相互作用的重要方法和手段。該方法的基本原理是利用轉錄激活因子(transcription activator，TA)的DNA結合結構域(DNA-binding domain，BD)和DNA激活結構域(DNA-activating domain，AD)可以分為兩個空間上相互獨立的功能單位這一特性，將“誘餌”蛋白與BD相融合，將可能與之相互作用的蛋白或被篩選的文庫與AD融合。如果兩者之間在酵母細胞內有相互作用，即使AD和BD在空間上相互靠近，啟動下游的報告基因。目前這一系統(tǒng)被廣泛應用于文庫篩選、蛋白質相互作用鑒定以及蛋白質相互作用的結構域鑒定等方面。相比于其他方法，酵母雙雜交系統(tǒng)具有更能模擬真核細胞內的作用環(huán)境、敏感性高、特異性好、高效等特點；而且經(jīng)改進后的一些雙雜交系統(tǒng)還能應用于膜蛋白之間相互作用、轉錄后修飾的蛋白質之間相互作用的驗證，以及蛋白復合體之間相互作用的驗證等。 經(jīng)過篩選，我們共得到3個可能與PRAK結合的蛋白，分別是MASP1(homo sapiens mannan-binding lectin serine protease 1)、SEPT8(homo sapiens septin 8)和DJ-1。DJ-1基因是由Daisuke Nagakubo等人在1997年發(fā)現(xiàn)的一種新的絲裂原依賴性癌基因，，其編碼的DJ-1蛋白能夠協(xié)同Ras蛋白引起小鼠NIH3T3細胞的轉化。該蛋白廣泛表達于人體各種組織，尤其在睪丸、前列腺、骨骼肌、腎臟、心臟、肝臟等組織中，表達量較高，并以二聚體的形式參與細胞的多種生命活動，如腫瘤發(fā)生、受精、雄激素受體調控、分子伴侶、抗氧化以及調控RNA結合復合體與RNA的結合等。已經(jīng)有文獻報道PRAK能夠被H_2O_2刺激激活，并且參與了人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)在氧應激時應力纖維的形成。而DJ-1在氧化應激時，能通過“扮演”分子伴侶、清道夫蛋白以及以致凋亡通路等多種方式有效地保護細胞抵抗氧自由基的損傷。在抑制細胞凋亡方面，DJ-1主要是通過與細胞核中Fas死亡結構域相關蛋白(Fas death domain-associated protein，Daxx)蛋白結合，抑制其出核，阻斷下游激酶ASK1的激活，最終抑制凋亡途徑。但DJ-1序列中并沒有NLS，因此DJ-1如何入核一直是一個迷。根據(jù)前期研究和我們篩選的結果，我們提出了關于DJ-1與PRAK的設想，即在氧化應激時，細胞內的PRAK和DJ-1會被激活，表達量上調，這時胞漿中的部分DJ-1就會與PRAK結合，并被PRAK通過某種方式攜帶入細胞核，進入細胞核的DJ-1就能與核內的Daxx蛋白結合并抑制其進入胞漿，使得胞漿中的ASK1激酶不能被激活，最終起到抑制細胞凋亡，保護細胞的抗氧化的功能。 如果上述假設能夠得到證實，對有關DJ-1和PRAK的功能研究具有重要意義，并且能夠以DJ-1和PRAK為切入點將p38信號通路與細胞凋亡途徑聯(lián)系起來。為此我們對DJ-1的定位、移位、抗氧化應激功能和DJ-1與PRAK的相互作用進行了初步研究，結果發(fā)現(xiàn)DJ-1與PRAK在體外可以特異性地結合。隨后，我們通過綠色熒光蛋白示蹤的方法發(fā)現(xiàn)，在正常情況下，DJ-1在細胞的胞漿、胞核都有表達，但以胞漿居多；在血清以及H_2O_2刺激情況下部分細胞中的DJ-1會從胞漿移位到胞核，這初步證實了我們關于DJ-1在氧化應激的情況下會入核的假設。免疫熒光發(fā)現(xiàn)，HA-PRAK和pEGFP-DJ-1在部分NIH3T3細胞的胞核中存在共定位，推測PRAK與DJ-1的共定位與細胞周期有關，因為有文獻報道，DJ-1的在血清刺激下的入核與細胞周期有關。我們還發(fā)現(xiàn)，當和HA-PRAK共轉時，胞核中EGFP-DJ-1的表達量有一定程度的升高，這一現(xiàn)象進一步被核質分離實驗所證實，這提示DJ-1和PRAK在胞核中存在相互作用。但是Flag-DJ-1與HA-PRAK在NIH3T3以及HEK293細胞中的免疫共沉淀未能測到陽性結果，這可能與我們所推測的PRAK與DJ-1僅在細胞周期的某一特定時期，才在細胞核內有共定位有關，因此我們還需要進一步改進實驗方法和條件，以獲得確切的實驗結果。最后我們將HEK293細胞轉染pcDNA3-Flag-DJ-1作為實驗組，轉染pcDNA3-Flag空載體和不轉染組作為兩個陰性對照，采用不同濃度的H_2O_2刺激24h，通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)，與兩個對照組相比，在200～600μmol／L濃度的H_2O_2范圍內，pcDNA3-Flag-DJ-1轉染組的細胞活力明顯較好，提示在該H_2O_2濃度刺激范圍內，F(xiàn)lag-DJ-1能有效地保護細胞抵抗氧化應激。 綜上所述，我們利用酵母雙雜交篩選系統(tǒng)，以PRAK為靶蛋白，篩選了人心臟cDNA文庫，得到3個可能與其相互作用的蛋白，為下一步深入研究PRAK功能和調節(jié)機制提供新的切入點；同時將篩選到的一個可能與PRAK有結合的蛋白DJ-1，克隆到真核以及原核表達載體上，做了體內、體外的結合實驗，證實兩者在體外能夠特異性結合；并在NIH3T3細胞核中存在共定位，過度表達的PRAK還能夠影響DJ-1的亞細胞定位，促進DJ-1移位入核。最后，還對DJ-1在真核細胞中的表達定位及與應激刺激關系作了初步探討，發(fā)現(xiàn)在靜息狀態(tài)下，DJ-1彌散分布在細胞的胞漿、胞核，但以胞漿為主。在受到血清以及H_2O_2刺激以后，部分細胞中的DJ-1會從胞漿移位到胞核。最后我們還通過XTT實驗證實，在200-600μmol／L濃度范圍內的H_2O_2刺激下，DJ-1能有效地保護細胞抵抗氧化應激。
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【學位授予單位】：第一軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R363

【參考文獻】

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本文編號：1355386