本文關(guān)鍵詞：聯(lián)合應(yīng)用DNA免疫和細(xì)胞加強(qiáng)制備CD55單克隆抗體及抗體生物學(xué)活性分析　出處：《中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)》2006年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：實(shí)驗(yàn)?zāi)康模河肈NA免疫和細(xì)胞加強(qiáng)方法制備抗人CD55分子單克隆抗體(Mab)，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究，確定該方法制備抗體的可行性。 實(shí)驗(yàn)方法：RT-PCR方法克隆CD55分子編碼區(qū)全長(zhǎng)基因，將擴(kuò)增基因定向?qū)胝婧吮磉_(dá)載體peDNA3.1和原核表達(dá)載體pET28a中。誘導(dǎo)pET28a／55載體在大腸桿菌Rosseta中表達(dá)CD55，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在。通過(guò)鹽酸胍變性溶解包涵體，并經(jīng)鎳柱純化得到重組CD55蛋白。重組質(zhì)粒pcDNA3.1／55采用多次肌肉注射方法免疫小鼠，并在每次DNA免疫前對(duì)小鼠股四頭肌做預(yù)處理①DNA免疫前1周注射蛇毒心肌毒素(Cardiotoxin)；②DNA免疫前15分鐘注射25％的高滲蔗糖溶液。與細(xì)胞融合前3天，用高表達(dá)CD55分子HPB-ALL細(xì)胞加強(qiáng)免疫一次，之后采用傳統(tǒng)的淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備抗CD55分子單克隆抗體。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)每次免疫后小鼠血清中抗體分泌情況。應(yīng)用夾心ELISA方法檢測(cè)抗體的類型，并利用抗體競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證制備抗體的表位。通過(guò)流式細(xì)胞儀(FACS)、熒光顯微鏡驗(yàn)證抗體與天然細(xì)胞膜蛋白的結(jié)合活性和特異性；Western blot印證抗體與變性線性蛋白結(jié)合活性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1)擴(kuò)增CD55全長(zhǎng)基因1174bp，構(gòu)建成pcDNA3.1／55重組質(zhì)粒。(2)采用FACS檢測(cè)血清滴度，3次DNA免疫后其最高為1：200，細(xì)胞加強(qiáng)后滴度最高為1：800。(3)通過(guò)細(xì)胞融合、篩選和克隆化培養(yǎng)最后得到兩株單克隆抗體分別為286E和286B。(4)兩株抗體IgG亞類均為IgG2a，輕鏈均為為κ型。(5)抗體免疫競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)表明286B、286E、IA10(BD)和67(Serotec)之間識(shí)別不同的抗原表位。(6)FACS、免疫熒光顯微鏡和Western blot實(shí)驗(yàn)表明抗體與天然細(xì)胞膜蛋白和變性膜蛋白及重組蛋白都有良好的結(jié)合活性和特異性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：pcDNA3.1／55肌肉內(nèi)免疫后能激發(fā)小鼠產(chǎn)生針對(duì)CD55分子的抗體，
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 鄧小玲;DNA疫苗的作用機(jī)理以及抗腫瘤的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊(cè));2005年01期

2 鄒強(qiáng),鄭萍,李華,郭波,謝佩蓉;DAF與CD3協(xié)同刺激人外周血T細(xì)胞活化的實(shí)驗(yàn)研究[J];免疫學(xué)雜志;2002年05期

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本文編號(hào)：1354988