本文關(guān)鍵詞：利用精子載體方法研制人組織型纖溶酶原激活劑突變體轉(zhuǎn)基因羊乳腺生物反應(yīng)器　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2005年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：利用轉(zhuǎn)基因動物乳腺生產(chǎn)醫(yī)藥用蛋白,具有產(chǎn)量高和生產(chǎn)成本低等明顯優(yōu)勢,前景普遍看好,但動物乳腺生物反應(yīng)器的獲得有賴于可靠的轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)制備技術(shù)作保證。 精子介導基因轉(zhuǎn)移(Sperm-mediated gene transfer,SMGT)被認為是目前操作最簡單的轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)技術(shù),但該方法的重復性差、實驗結(jié)果不穩(wěn)定,因此也是一種不成熟的技術(shù)體系�；赟MGT的不成熟性,本實驗將對SMGT的幾個關(guān)鍵環(huán)節(jié)進行研究,以期建立穩(wěn)定、高效的SMGT技術(shù)平臺,同時利用該技術(shù)平臺研制人組織型纖溶酶原激活劑突變體(variant form of human tissue-type plasminogen activator,mt-PA)轉(zhuǎn)基因羊乳腺生物反應(yīng)器,為安全高效的溶栓藥物mt-PA規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。實驗結(jié)果如下: 1)山羊精子可自發(fā)性結(jié)合外源DNA,精子對外源DNA的結(jié)合和內(nèi)化能力在不同個體間差異顯著(P0.01)。對于同一供體的精子而言,阻止DNA結(jié)合的最主要因素是精漿,離心洗滌后,結(jié)合率和內(nèi)化率可提高數(shù)倍。 2)死精子同樣能結(jié)合外源DNA,但不能將其內(nèi)化,反復凍融導致質(zhì)膜破裂的死精子具有更高的結(jié)合率,而且與動物個體無關(guān)。 3)精漿既可能與DNA形成復合物,改變DNA的物理性質(zhì),又可能對游離DNA產(chǎn)生降解,精漿的作用效應(yīng)呈濃度和時間依賴性;EGTA對精漿的復合效應(yīng)和降解效應(yīng)有明顯的抑制作用。 4)內(nèi)化進入精細胞中的外源DNA大部分將被降解,EGTA/ATA能有效保護內(nèi)化DNA的完整性而不影響精子的其他生物學特性。 5)轉(zhuǎn)染精子用于體外受精,報告基因GFP可被精子介導進入卵母細胞,并在早期胚胎中表達,胚胎陽性率和GFP表達率與精子結(jié)合外源DNA的能力相關(guān)。 6)精子與山羊乳腺特異性表達pBGC-mtPA線性化質(zhì)粒DNA共同孵育后,人工受精得到129只羔羊,其中24只PCR陽性(陽性率18.6%),15只Southern blot陽性(陽性率11.6%,15/129)。但轉(zhuǎn)染精子受精能力下降,畸形羔羊增多,生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因羊部分可能是嵌合體或者是部分片段整合。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2005
【分類號】：R346

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本文編號：1352793