本文關鍵詞：子宮內(nèi)膜巨噬細胞對血管內(nèi)皮生長因子A的表達及胚胎著床的影響

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【摘要】：研究背景胚胎著床是妊娠過程的主要限制步驟,也是胚胎發(fā)育伊始最重要的一個環(huán)節(jié)。胚胎著床是一個非常復雜而精密調(diào)控的母胎對話過程：一方面從卵母細胞透明帶消失,到分化出合體滋養(yǎng)細胞,胚胎需要正常的發(fā)育；另一方面孕婦體內(nèi)有足夠數(shù)量的孕酮,在激素的刺激下,在人類通常為排卵后7天,子宮有一極短敏感期稱為著床窗,允許胚胎著床。只有兩方面同步發(fā)育且功能協(xié)調(diào),胚泡經(jīng)過轉運、定位、黏附、和穿入,才能最終成功著床。在任一步驟發(fā)生異常,都可能導致著床失敗。對子宮內(nèi)膜組織學研究顯示,局部血管生成處于高峰狀態(tài)是圍著床期子宮內(nèi)膜最明顯的標志之一,這種血管生成微環(huán)境的功能正常是胚胎著床、胎盤形成和妊娠維持的先決條件。近年來,巨噬細胞(macrophages, Mφ)于著床窗在子宮內(nèi)膜的聚集和其可能參與著床的機制引起越來越多學者的興趣。作為機體固有免疫的重要組成細胞,蛻膜巨噬細胞(decidual macrophage, dMcp)具有截然不同的表型,不能被簡單歸類為促炎M1或抗炎M2型,胚胎的著床造成內(nèi)膜微環(huán)境的炎癥狀態(tài),蛻膜免疫細胞大量募集,巨噬細胞約占其中20%。對反復著床失敗的患者人工誘導無菌性炎癥反應,巨噬細胞的明顯聚集能促進胚胎著床,增加妊娠率,但其具體機制尚不明確。著床窗小鼠子宮內(nèi)膜的微血管環(huán)境改變是子宮內(nèi)膜容受性建立的關鍵。著床后子宮內(nèi)膜巨噬細胞募集數(shù)量與局部血管生成具有相關性增長,均提示巨噬細胞在著床期子宮內(nèi)膜可能發(fā)揮著除介導免疫耐受外更多的作用,例如維持蛻膜血管生成微環(huán)境平衡的潛在功能。惡性腫瘤的侵襲和生長在一定程度上與胚胎粘附和著床過程相似,惡性腫瘤的侵襲過程中,巨噬細胞參與了血管生成。當外周循環(huán)血中的單核細胞遷移到腫瘤組織后,在腫瘤微環(huán)境的作用下分化為腫瘤相關性巨噬細胞(tumor associated macrophages, TAM)。TAM被發(fā)現(xiàn)在維持腫瘤局部毛細血管網(wǎng)的平衡中的重要作用,TAM加速血管的生長增長是通過上調(diào)和釋放促血管因子而得以實現(xiàn)。這些促血管因子也是腫瘤微環(huán)境巨噬細胞向M2極化或M1/M2混合表型的體現(xiàn)。TAM最為主要的促血管因子是血管內(nèi)皮生長因子A (VEGF-A, or VEGF)。在很多類型的人類癌癥中VEGF-A的水平與TAM密度相關。例如乳腺癌中,腫瘤的無血管缺氧區(qū)域,TAM能夠產(chǎn)生VEGF-A。iNOS即巨噬細胞一氧化氮合成酶,在靜止的巨噬細胞中檢測不到NOS,但受免疫或炎癥刺激激活的巨噬細胞誘導后,會有大量酶的形成,能持續(xù)而大量的釋放一氧化氮(NO)。TAM的相關研究顯示對血管新生的雙向調(diào)節(jié)可能主要是通過對VEGF合成的影響間接實現(xiàn)的,也就是說NO與VEGF共同組成調(diào)節(jié)血管生成的功能蛋白質(zhì)復合體,NO扮演著VEGF合成的上游調(diào)節(jié)因子的角色,這種調(diào)節(jié)功能與局部NO濃度梯度、氧分壓、NO供體等因素緊密相關：低氧環(huán)境下少量NO可能通過絲裂原蛋白活化激酶(MAPK)或p38激酶通路上調(diào)VEGF基因的表達,其間可能還有低氧誘導蛋白(HIF).1和血紅素氧化酶(HO).1的參與；但大量NO抑制VEGF基因的表達通路尚未明了。TAM在腫瘤微環(huán)境血管生成中的地位和靶標治療已成為腫瘤基礎研究中的熱點問題。我們前期工作中發(fā)現(xiàn),在妊娠小鼠胚胎著床后dMφ、VEGF-A、iNOS的表達強度顯著增高,并與新生血管密度存在正相關關系,那么子宮巨噬細胞是否也參與了胚胎著床中蛻膜局部血管微環(huán)境的構建,進而參與胚胎著床?這是本課題的研究重點。迄今為止,尚未見到國內(nèi)外對著床期子宮內(nèi)膜巨噬細胞進行局部抑制的方法,用以研究其參與胚胎著床的機制。全身敲除巨噬細胞的小鼠存在卵巢血管網(wǎng)破壞、孕酮水平的下降,動情周期紊亂,下丘腦垂體性腺軸的功能受損,這可能是導致模型中胚胎著床失敗的主要原因。卵巢的排卵功能及激素分泌功能在妊娠中的重要作用毋庸置疑,全身敲除巨噬細胞的模型不僅影響排卵而且干預了妊娠維持最為重要的孕激素,并不能說明巨噬細胞本身在著床關鍵期在子宮內(nèi)膜局部發(fā)揮的特定作用,因此為避免卵巢及全身巨噬細胞的影響,我們希望通過建立小鼠著床期子宮局部巨噬細胞抑制模型,用以研究小鼠子宮內(nèi)膜巨噬細胞對子宮內(nèi)膜容受性及胚胎著床過程的影響。脂質(zhì)體是一種人工合成的具有雙分子層結構的封閉囊泡。利用能和細胞膜融合的特點,脂質(zhì)體可作為載體將藥物送入細胞內(nèi)部,以達到靶向目的。水溶狀態(tài)下的氯膦酸二鈉不能跨越脂質(zhì)體和細胞的磷脂雙分子膜,當包裹于脂質(zhì)體內(nèi)后,即可被巨噬細胞特異性吞噬,巨噬細胞的膦酯酶破壞脂質(zhì)體后氯膦酸二鈉被釋放到胞質(zhì)內(nèi),達到特定濃度即可引起巨噬細胞的凋亡。有學者報道了氯膦酸二鈉脂質(zhì)體(Clodronate Liposomes,CL)局部作用于睪丸、卵巢的實驗研究,均能有效剔除局部巨噬細胞。因此,本研究利用巨噬細胞特異性清除劑CL,建立巨噬細胞抑制小鼠模型；并在小鼠的著床關鍵期抑制子宮內(nèi)膜局部的巨噬細胞,觀察著床點和非著床點中其對VEGFA、iNOS表達影響,及其對胚胎著床的影響。深入研究圍著床期子宮內(nèi)膜血管生成微環(huán)境的調(diào)節(jié)機制,有助于進一步理解子宮內(nèi)膜容受性的內(nèi)涵,為探索干預子宮內(nèi)膜容受性調(diào)節(jié)的新靶點提供更充分的科學依據(jù),并能為推動著床障礙(反復體外受精.胚胎移植失敗和習慣性流產(chǎn))、不明原因性不孕的促血管生成治療奠定實驗基礎,同時也為異常子宮出血、免疫避孕、器官移植研究提供新的思路,對于改善女性生殖能力及治療不孕不育和復發(fā)性流產(chǎn)等相關疾病具有重要意義。目的建立子宮內(nèi)膜局部抑制巨噬細胞的小鼠模型,觀察著床期巨噬細胞抑制對胚胎著床影響,研究小鼠子宮內(nèi)膜巨噬細胞對VEGFA、iNOS表達的影響,并研究子宮內(nèi)膜著床位點與非著床位點巨噬細胞、VEGFA、iNOS的分布差異,進一步探討其在胚胎著床中的作用。方法1)取成熟未育的昆明種小鼠為研究對象,陰道涂片觀察細胞組織學變化,確定動情期小鼠。取動情期小鼠30只,隨機分為兩種注射途徑給藥,尾靜脈注射(n=15)和宮腔內(nèi)注射(n=15)。小鼠隨機分為三組,實驗組(n=5),對照組(n=5)和空白組(n=5)。尾靜脈組中,實驗組從尾靜脈緩慢推注包裹有氯膦酸二鈉的脂質(zhì)體混懸液0.1ml/10g,對照組包裹有磷酸緩沖鹽的脂質(zhì)體(PBS liposomes, PL),空白組則注射滅菌PBS。宮腔內(nèi)注射中,分別用微量注射器,手術直視下由卵巢側宮角向?qū)m腔內(nèi)注射包裹有氯膦酸二鈉的脂質(zhì)體混懸液、包裹有PBS脂質(zhì)體和滅菌PBS各15u1。2)于注射后48h,采用免疫組織化學法、流式細胞學方法檢測射氯膦酸二鈉脂質(zhì)體對子宮F4/80+巨噬細胞的抑制效率。擇優(yōu)選取宮腔內(nèi)注射建立小鼠著床期子宮內(nèi)膜巨噬細胞抑制模型。3)取D3.5(雌鼠交配后次日晨陰道見栓為D0.5)孕鼠30只,隨機分為三組,實驗組(n=10)、對照組(n=10)和空白組(n=10)。使用微量注射器從近卵巢側子宮角部向?qū)m腔內(nèi)緩慢注入15ul藥物。實驗組向左側宮腔內(nèi)注射CL,右側注射包裹有PBS脂質(zhì)體；對照組向雙側宮腔內(nèi)注射PL；空白組向雙側宮腔內(nèi)注射等體積滅菌PBS溶液作為空白對照。4)獲取D5.5小鼠子宮和卵巢,臺盼蘭染色顯示各單側子宮的胚胎著床數(shù),HE染色觀察著床點組織形態(tài)變化。5)采用免疫組化技術檢測子宮內(nèi)膜、卵巢內(nèi)巨噬細胞數(shù)量變化。流式細胞學方法檢測子宮F4/80+CD11b+巨噬細胞相對百分比,驗證注射CL對著床期子宮巨噬細胞的選擇性抑制作用。6)免疫組織化學方法觀察著床位點和非著床位點巨噬細胞、VEGFA、iNOS的表達變化。結果1)宮腔內(nèi)注射后,HE染色顯示小鼠子宮組織完整,腺體結構清晰,無炎性細胞浸潤。2)在對動情期小鼠進行尾靜脈注射、宮腔內(nèi)注射后48h,免疫組織化學方法檢測實驗組的子宮內(nèi)膜巨噬細胞數(shù)量與對照組(P0.01)、空白組(P0.01)相比均顯著減少。兩種方法在子宮內(nèi)膜巨噬細胞的抑制程度無明顯差異(P=0.788)。3)宮腔內(nèi)注射后48h,實驗組的卵巢巨噬細胞數(shù)量與對照組、空白組相比無明顯差異(P=0.762)。采用尾靜脈途徑注射脂質(zhì)體后,對照組、空白組與宮腔內(nèi)注射結果相似,但實驗組卵巢內(nèi)巨噬細胞卻有所下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。尾靜脈注射相比宮腔內(nèi)注射對卵巢巨噬細胞有明顯抑制作用(P0.05)。4)流式細胞學檢測動情期小鼠尾靜脈注射、宮腔內(nèi)注射后48h,實驗組F4/80+巨噬細胞較對照組及空白組均顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義。5)著床期宮腔內(nèi)注射CL后,免疫組織化學檢測方法檢測到著床位點上,實驗組左側注射CL的子宮內(nèi)膜巨噬細胞數(shù)(22.50±=8.15)較PL側(83.60±12.15)顯著降低,較對照組左側和空白組左側也顯著降低(P0.05),三組的右側則無明顯差異。非著床位點巨噬細胞數(shù)變化與之類似。著床位點的巨噬細胞均高于非著床位點,巨噬細胞具有聚集于著床位點的趨勢。6)實驗組左側子宮宮腔內(nèi)注射CL后48h,對小鼠子宮單細胞懸液用流式細胞學方法檢測F4/80+CD11b+巨噬細胞相對比例較實驗組注射PL側、對照組和空白組的各側有顯著下降,抑制率為74%。7)著床期宮腔內(nèi)注射CL后,實驗組卵巢的巨噬細胞數(shù)量與對照組、空白組相比無明顯差異。8)當抑制了著床期間子宮局部的巨噬細胞后,胚胎著床數(shù)顯著降低,胚胎著床被部分抑制。實驗組左側注射CL后平均胚胎著床數(shù)為2.20±1.81個,顯著低于實驗組右側注射PL、空白組左側及對照組左側,平均著床位點分別：5.10±1.91個,5.00±2.21,5.80±2.25(P0.05),三組右側無明顯差異。9)在實驗組注射CL側僅有的胚胎著床位點,雖可見胚胎結構,但宮腔未閉合,蛻膜化范圍較實驗組PL側縮小。PL側小鼠著床位點上皮細胞明顯水腫,間質(zhì)細胞明顯蛻膜化,宮腔閉合。10)在著床位點,隨著實驗組注射CL側的子宮巨噬細胞受到抑制,子宮內(nèi)膜的VEGFA蛋白表達明顯低于實驗組右側注射PL(P0.05),非著床點實驗組注射CL側的子宮VEGFA的表達較PL側雖有所降低,但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.069),實驗組兩側的VEGFA表達在著床位點的均高于非著床位點(P0.05)。11)實驗組注射CL側和PL側子宮內(nèi)膜的iNOS陽性細胞數(shù)量無明顯差異(P=0.552)。非著床點iNOS的表達在CL側與PL側之間無明顯差異(p=0.711)。實驗組PL側子宮iNOS陽性細胞數(shù)在著床位點的高于非著床位點,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。而CL側iNOS陽性細胞數(shù)在著床位點雖高于非著床位點,但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.118)。結論1)嚴格遵守無菌操作的宮腔內(nèi)注射并不影響子宮組織完整性,可作為宮腔內(nèi)給藥的途徑。2)利用巨噬細胞特異性清除劑氯膦酸二鈉脂質(zhì)體,通過兩種途徑：尾靜脈注射與宮腔內(nèi)注射,均能有效抑制小鼠子宮巨噬細胞,而通過宮腔內(nèi)注射可有效避免對卵巢的影響,且單側的藥物給藥可以使得兩側的子宮互為對照,為精確研究子宮內(nèi)膜巨噬細胞的功能提供良好的動物模型,在國內(nèi)外為首次報道。3)抑制子宮局部巨噬細胞導致胚胎著床率下降,著床部位蛻膜化不完全,宮腔不能閉合,證明子宮內(nèi)膜中的巨噬細胞為胚胎著床所必需。4)當著床期抑制子宮內(nèi)膜巨噬細胞后,著床點VEGFA的表達隨巨噬細胞的抑制一致性降低,提示巨噬細胞可能是通過調(diào)控VEGFA的表達,參與構建蛻膜局部血管生成微環(huán)境,從而影響子宮內(nèi)膜容受性及胚胎著床。5)子宮的iNOS表達并不隨子宮巨噬細胞的抑制而降低,可能其表達并不完全受巨噬細胞影響,存在其他途徑代替調(diào)控。6)巨噬細胞、VEGFA、iNOS在著床點的表達高于非著床點,其差異進一步說明巨噬細胞、VEGFA、iNOS不僅與胚胎著床相關,也可能參與了著床點的選擇,其具體機制還需要進一步研究。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R321

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