本文關鍵詞：VNN1調節(jié)炎癥狀態(tài)下的肝臟Hepcidin表達及肝鐵紊亂的分子機制

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【摘要】：鐵代謝紊亂是一種常見的疾病,與炎癥、糖尿病、心血管等代謝性疾病息息相關,嚴重影響著人們的生活質量。因此,深入研究機體鐵代謝的精密調控顯得尤為重要。Hepcidin是一種肝臟合成并分泌的抗菌多肽,富含半胱氨酸,它在調控機體鐵穩(wěn)態(tài)中起著關鍵性作用。簡單地說,機體內的Hepcidin可以與位于巨噬細胞和腸細胞的細胞膜表面的Ferroportin1 (FPN1)蛋白結合,進而將其內化和降解。由于FPN1是胞內鐵輸出的唯一通道,所以,Hepcidin可以通過調節(jié)FPN1來調控機體鐵運輸。機體內Hepcidin的水平處于動態(tài)平衡中,如果這個平衡被打破,會導致鐵的缺乏或過載,從而引發(fā)一系列疾病。因此,維持機體Hepcidin的動態(tài)平衡就變得至關重要。研究表明,Hepcidin的表達受多種因素的調節(jié),如機體的鐵水平、炎癥和缺氧。除此以外,人類許多代謝性紊亂疾病也與Hepcidin的紊亂密切相關,如遺傳性血色素沉著病(hereditary hemochromatosis, HH)、炎性貧血(anemia of inflammation, AI)、慢性腎病(chronic kidney diseases)等。臨床數據顯示,在慢性炎癥病人體內Hepcidin的表達比健康人群要高,從而引發(fā)炎性貧血。對于這方面的機制研究,目前僅停留在炎性因子IL-6可通過STAT-3 (signal transduction and activator of transcription-3)信號通路增加Hepcidin的表達,但哪些媒介物傳遞炎癥信號來調控肝鐵穩(wěn)態(tài)尚未知曉。VNN1是一種在腸和肝臟組織中高表達的GPI-錨定蛋白質,具有泛酰巰基乙胺酶的活性。該酶水解泛酰巰基乙胺(pantetheine)形成巰基乙胺(pantothenic acid, vitamin B5)和半胱胺(Cysteamine)。研究表明,半胱胺(Cysteamine)在體內通過巰基二硫化物的交換反應生成氧化形式的胱胺(Cystamine),而胱胺正是許多重要代謝途徑的關鍵調節(jié)因子。實驗證明,VNN1全身性敲除的小鼠能抵抗2,4,6-三硝基苯磺酸基酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)造成的大腸炎。然而,令人驚奇的是,用胱胺處理上述小鼠可以完全逆轉這種保護機制。綜合前人的研究結果,我們不難發(fā)現(xiàn)炎癥信號、VNN1及Hepcidin之間似乎存在著某種聯(lián)系,因此,本文主要探究在炎癥狀態(tài)下,VNN1調節(jié)肝臟Hepcidin表達及肝鐵穩(wěn)態(tài)的分子機制。本文主要采用功能獲得(gain-of-function)和功能缺失(loss-of-function)的過表達和干擾的方法。在細胞水平研究炎癥狀態(tài)下,VNN1調節(jié)Hepcidin表達及其分子機制。運用VNN1腺病毒和小干擾RNA siVNN1介導的過表達和干擾技術,采用實時定量PCR和Western Blot分析VNN1對Hepcidin表達的影響。同時,運用普魯士藍染色的方法分析肝鐵堆積情況。在分子機制層面,我們檢測了NF-κB的活性變化。隨后,運用熒光素酶報告基因檢測(Luciferase reporter assay)實驗,研究VNN1調控hepcidin基因啟動子的轉錄活性的機制。我們的研究結果證明,在小鼠的原代肝細胞中,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)能顯著性地上調VNN1和Hepcidin的表達水平,該結果暗示了VNN1可能在LPS調控Hepcidin表達的過程中發(fā)揮著潛在的作用。過表達VNN1濃度梯度依賴性地增加Hepcidin的表達和肝鐵堆積,而干擾VNN1出現(xiàn)相反的效果。上述結果表明,VNN1和Hepcidin的表達水平呈正相關性。最重要的是,干擾VNN1有效地拮抗LPS誘導Hepcidin的表達及肝鐵紊亂。在分子機制層面上,NF-κB作為經典的信號通路參與調控炎癥反應,同時,近年報道也表明在hepcidin基因啟動子的-509 bp有一個NF-κB的結合位點,可以激活hepcidin基因的轉錄,所以,我們推測VNN1可能是通過激活NF-κB的活性在轉錄水平調控hepcidin基因的表達。我們通過細胞免疫熒光實驗表明VNN1激活NF-κB的核轉位。此外,BAY 11-7082 (NF-κB的抑制劑)處理能部分削弱過表達VNN1對Hepcidin的上調效果。普魯士藍染色的結果也驗證了上述結果。細胞免疫熒光實驗進一步說明NF-κB參與VNN1調控Hepcidin表達的過程。而干擾VNN1也能部分緩解LPS對NF-κB的激活效果。熒光素酶報告基因檢測實驗表明,干擾VNN1有效地抑制LPS對hepcidin基因啟動子的激活作用。另一方面,我們的實驗中VNN1的水解產物半胱胺(Cysteamine)的氧化形式胱胺(Cystamine)完全逆轉干擾VNN1對Hepcidin表達的抑制作用,進一步證明了VNN1確實在調節(jié)肝臟Hepcidin的表達和維持肝鐵穩(wěn)態(tài)過程中起著關鍵性的作用。綜上所述,我們的研究充分證明,在細胞水平上,VNN1增加肝臟Hepcidin的表達及肝鐵堆積,而NF-κB的核轉位在該現(xiàn)象中發(fā)揮著重要的作用。此外,VNN1的水解產物之一半胱胺也參與此過程。我們的研究首次探討了細胞膜錨定蛋白VNN1、 Hepcidin及肝鐵堆積之間的關系,并從分子機制層面對其進行了深入的研究,豐富了現(xiàn)有VNN1的功能,并進一步完善了Hepcidin調節(jié)肝鐵穩(wěn)態(tài)的理論認知,同時為從不同角度治療炎癥相關的肝鐵紊亂的代謝性疾病提供了新的理論依據和藥物靶點。
【學位授予單位】：南京師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R363

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