發(fā)布時(shí)間：2017-10-24 06:14

  本文關(guān)鍵詞：CHO細(xì)胞表達(dá)重組人絨毛膜促性腺激素性腺激素的調(diào)控機(jī)理研究

  更多相關(guān)文章： 細(xì)胞培養(yǎng) 人絨毛促性腺激素(hCG) 表達(dá)調(diào)控機(jī)理

【摘要】：人絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin, hCG)是由胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞合成和分泌的一種雙亞基糖蛋白激素,在治療女性不孕、誘導(dǎo)排卵以及某些疾病的檢測(cè)中起到重要的作用。傳統(tǒng)hCG的生產(chǎn)方法是從孕婦尿中提取,但這種方法存在許多缺點(diǎn),比如來(lái)源不受控制,純化困難,批次間差異較大等,限制了hCG的臨床使用。目前已有商品化的重組hCG (rhCG)上市,但由于對(duì)蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)理缺乏了解,蛋白表達(dá)水平偏低。本文通過(guò)FLP-In定點(diǎn)整合系統(tǒng)篩選出了不同rhCG表達(dá)水平的穩(wěn)定細(xì)胞株,并通過(guò)對(duì)不同表達(dá)水平細(xì)胞株的轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平、組裝折疊水平以及分泌水平的研究,揭示了rhCG蛋白表達(dá)的限制因素。 通過(guò)考察不同表達(dá)水平細(xì)胞株的mRNA豐度以及mRNA的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄速率,以及通過(guò)ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)不同表達(dá)水平細(xì)胞株的胞內(nèi)胞外α亞基多肽、β亞基多肽以及完整hCG蛋白濃度,本文揭示了rhCG蛋白表達(dá)過(guò)程的各種限制因素：第一,不同表達(dá)水平細(xì)胞株β亞基的mRNA水平相對(duì)較高,這可能是rhCG蛋白表達(dá)所必需的,過(guò)量的β亞基合成可能能夠促進(jìn)rhCG的合成。進(jìn)一步通過(guò)驗(yàn)證mRNA的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄速率,證實(shí)了轉(zhuǎn)錄水平的差異并不是由于各亞基mRNA的穩(wěn)定性差異引起的而是由于轉(zhuǎn)錄速率的差異引起的；第二,相比于β亞基的mRNA豐度,高表達(dá)細(xì)胞株中α亞基的轉(zhuǎn)錄水平存在明顯限制；第三,在高表達(dá)細(xì)胞株中,無(wú)論是α亞基還是β亞基其從mRNA到多肽的合成步驟均存在明顯限制,β亞基的限制尤其顯著。這可能與β亞基的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性有關(guān),β亞基比α亞基多一個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵和四個(gè)O糖鏈,細(xì)胞O糖鏈修飾能力的缺乏可能是導(dǎo)致這種限制發(fā)生的主要原因；第四,在本研究的rhCG蛋白表達(dá)水平下,蛋白在組裝和分泌水平均不存在明顯限制。 本文提出了一種雙亞基蛋白表達(dá)調(diào)控機(jī)理研究的方法,揭示了rhCG蛋白表達(dá)過(guò)程的限制因素,對(duì)于構(gòu)建高表達(dá)的rhCG工程細(xì)胞株具有重要的指導(dǎo)意義。
【關(guān)鍵詞】：細(xì)胞培養(yǎng) 人絨毛促性腺激素(hCG) 表達(dá)調(diào)控機(jī)理
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第1章 文獻(xiàn)綜述10-23
• 1.1 人絨毛膜促性腺激素10-12
• 1.1.1 人絨毛膜促性腺激素的簡(jiǎn)介10-11
• 1.1.2 人絨毛膜促性腺激素的臨床作用11
• 1.1.3 人絨毛膜促性腺激素的生產(chǎn)方法簡(jiǎn)介11-12
• 1.2 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白藥物12-14
• 1.2.1 國(guó)內(nèi)外重組蛋白藥物的發(fā)展進(jìn)程12
• 1.2.2 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)表達(dá)系統(tǒng)12-14
• 1.3 定點(diǎn)整合系統(tǒng)篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株14-17
• 1.3.1 FLP-In定點(diǎn)整合系統(tǒng)的簡(jiǎn)介14-17
• 1.3.2 FLP-In定點(diǎn)整合系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)17
• 1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR17-19
• 1.4.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的簡(jiǎn)介17-18
• 1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的相對(duì)定量18-19
• 1.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的絕對(duì)定量19
• 1.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用19
• 1.5 外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)過(guò)程中限制因素的研究19-21
• 1.5.1 載體設(shè)計(jì)、質(zhì)粒整合和染色體環(huán)境20
• 1.5.2 mRNA的穩(wěn)定性和加工處理20-21
• 1.5.3 蛋白質(zhì)的翻譯和分泌21
• 1.6 研究?jī)?nèi)容與研究意義21-23
• 第2章 人絨毛膜促性腺激素表達(dá)載體的構(gòu)建23-40
• 2.1 前言23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料23-24
• 2.2.1 菌株和質(zhì)粒23
• 2.2.2 培養(yǎng)基和溶液23-24
• 2.2.3 主要試劑、試劑盒、儀器設(shè)備及分析軟件24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法24-31
• 2.3.1 菌種培養(yǎng)和保藏24
• 2.3.2 質(zhì)粒抽提步驟24-25
• 2.3.3 瓊脂糖凝膠回收步驟25
• 2.3.4 DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備步驟25-26
• 2.3.5 DH5α感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化26
• 2.3.6 包含兩個(gè)PCMV-BGHpA表達(dá)框的pcDNA5/FRT載體構(gòu)建26-28
• 2.3.7 含有α亞基的pcDNA5/FRT(2)-α載體的構(gòu)建28-30
• 2.3.8 含有α亞基和β亞基的pcDNA5/FRT-hCGαβ載體的構(gòu)建30-31
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-39
• 2.4.1 包含兩個(gè)PCMV-BGHpA表達(dá)框的pcDNA5/FRT載體構(gòu)建31-35
• 2.4.2 含有α亞基的pcDNA5/FRT(2)-α載體構(gòu)建35-37
• 2.4.3 含有β亞基的pcDNA5/FRT-hCGαβ載體構(gòu)建37-39
• 2.5 小結(jié)39-40
• 第3章 FLP-In定點(diǎn)整合系統(tǒng)和流式細(xì)胞儀細(xì)胞分選技術(shù)的建立40-47
• 3.1 前言40
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料40-42
• 3.2.1 細(xì)胞株、質(zhì)粒40-41
• 3.2.2 培養(yǎng)基和溶液41
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器41-42
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法42-43
• 3.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)42
• 3.3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染42
• 3.3.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率42
• 3.3.4 FLP-In定點(diǎn)整合系統(tǒng)宿主細(xì)胞株的篩選42-43
• 3.3.5 FLP-In定點(diǎn)整合系統(tǒng)表達(dá)細(xì)胞株的篩選43
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-45
• 3.4.1 FLP-In定點(diǎn)整合系統(tǒng)宿主細(xì)胞系篩選轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定43-44
• 3.4.2 流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞44-45
• 3.5 小結(jié)45-47
• 第4章 CHO細(xì)胞表達(dá)rhCG蛋白的表達(dá)調(diào)控機(jī)理研究47-59
• 4.1 前言47
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料47-48
• 4.2.1 細(xì)胞株、培養(yǎng)基47
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器47-48
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法48-52
• 4.3.1 總RNA抽提和hCG mRNA的測(cè)定48-49
• 4.3.2 hCG各亞基mRNA穩(wěn)定性分析49
• 4.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備49-50
• 4.3.4 轉(zhuǎn)錄速率分析50-51
• 4.3.5 ELISA方法檢測(cè)hCG各亞基和完整hCG蛋白的濃度51-52
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-57
• 4.4.1 不同表達(dá)水平細(xì)胞株各亞基mRNA水平的比較52-53
• 4.4.2 不同表達(dá)水平細(xì)胞株各亞基mRNA穩(wěn)定性的比較53-54
• 4.4.3 不同表達(dá)水平細(xì)胞株轉(zhuǎn)錄速率的比較54-55
• 4.4.4 不同表達(dá)水平細(xì)胞株胞內(nèi)胞外α亞基多肽和β亞基多肽水平的比較55-56
• 4.4.5 不同表達(dá)水平細(xì)胞株胞內(nèi)胞外完整rhCG蛋白濃度的比較56-57
• 4.5 小結(jié)57-59
• 第5章 總結(jié)與展望59-61
• 5.1 總結(jié)59
• 5.2 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)59-60
• 5.3 展望60-61
• 參考文獻(xiàn)61-68
• 致謝68

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 羅愛(ài)月;楊書紅;沈薇;丁婷;賴志文;王毅;盧運(yùn)萍;王世宣;;卵巢催乳素受體mRNA在小鼠卵泡發(fā)育及排卵過(guò)程中的表達(dá)[J];中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;2010年04期

2 齊利枝;生冉;閆素梅;趙艷麗;;乙酸濃度對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯含量及瘦素和過(guò)氧化物酶增殖物激活受體γ基因表達(dá)量的影響[J];動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào);2013年07期

3 王秀美;侯先志;敖長(zhǎng)金;高民;考桂蘭;高愛(ài)武;蘭儒冰;塔娜;;三維模式下培養(yǎng)時(shí)間對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白基因表達(dá)的影響[J];動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào);2013年07期

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5 倪娟;李珍;薛京倫;汪旭;;表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)人成淋巴細(xì)胞株hMLH1和hMSH2 mRNA表達(dá)的影響[J];癌變·畸變·突變;2013年04期

6 鄭旭青;代天星;林曉敏;熊浩;楊海弟;;KCNJ10通道蛋白在C57BL/6J小鼠耳蝸的年齡相關(guān)性表達(dá)及與聽(tīng)力關(guān)系[J];中國(guó)耳鼻咽喉頭頸外科;2013年08期

7 文惠方;蔣春梅;張尚弟;車團(tuán)結(jié);黃超杰;趙峰;;宮腔脫落細(xì)胞中p53、ki-67、bcl-2、bax基因的表達(dá)及意義[J];中國(guó)婦產(chǎn)科臨床雜志;2013年05期

8 孫敏敏;劉含亮;王紅衛(wèi);孟曉;王紀(jì)亭;萬(wàn)文菊;;酵母鉻對(duì)尼羅羅非魚(yú)生長(zhǎng)和糖代謝的影響[J];動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào);2013年09期

9 朱鐵錘;;NLRP3在馬兜鈴酸致腎損傷小鼠腎臟組織中的表達(dá)及其意義[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2013年05期

10 李欣;徐波;;中等強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)心臟局部Ang II及AT_1R表達(dá)的影響[J];北京體育大學(xué)學(xué)報(bào);2013年08期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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2 王志剛;嚴(yán)志;章必成;饒智國(guó);余麗芳;劉健;高建飛;;基于芯片數(shù)據(jù)的隨機(jī)森林算法鑒定結(jié)腸癌生物標(biāo)記物(英文)[A];第四屆湖北省抗癌協(xié)會(huì)青年委員會(huì)學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2012年

3 任廣睦;趙晉芳;梁新華;黃新宇;;死亡人體胸肌組織中rRNA亞基的穩(wěn)定性[A];全國(guó)第九次法醫(yī)學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2013年

4 姜建萍;徐日福;范賢聰;張英英;劉強(qiáng);楊雨江;;大骨雞FSHβ與PIT1基因多態(tài)性及其聚合基因型對(duì)產(chǎn)蛋性能的影響[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家禽學(xué)分會(huì)第九次代表會(huì)議暨第十六次全國(guó)家禽學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2013年

5 Ruiwen Fan;Shanshan Yang;Zhanquan Shi;Kaiyuan Ji;Xiaoyun Jia;Jianbo Yao;George W Smith;Changsheng Dong;;Identification of a novel miRNA important for melanogenesis in alpaca(Lama Pacos)[A];2013中國(guó)駝業(yè)進(jìn)展[C];2013年

6 郭翔羽;劉璇;徐仙洲;吳蒙;張旭;李強(qiáng);劉文嬌;張毅;王雅春;俞英;;牛DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a/3b基因(DNMT3a/3b)的表達(dá)對(duì)肉質(zhì)性狀的影響[A];《第八屆中國(guó)牛業(yè)發(fā)展大會(huì)》論文集[C];2013年

7 王曉珂;趙健亞;劉天娥;陳致飛;張璇;王春;陳剛;;白藜蘆醇對(duì)高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖易感和肥胖抵抗大鼠體重的影響及相關(guān)機(jī)制[A];2013中國(guó)環(huán)境科學(xué)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（第七卷）[C];2013年

8 Huang Qiang;Gong Yuehua;Wei Anqing;Peng Xiaoling;;Effects of hBD-3 on Staphylococcus aureus biofilm formation-regulating genes dltB and icaA genes[A];江西省第八次中西醫(yī)結(jié)合危重病、急救醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2013年

9 田，

本文編號(hào)：1087422