發(fā)布時間：2017-10-13 16:25

  本文關(guān)鍵詞：剛地弓形蟲R0P18-R0P12復(fù)合基因疫苗對小鼠的免疫保護(hù)性研究

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【摘要】：剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii,T.gondii)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原蟲,能感染多種脊椎動物,包括鳥類及陸地上和海洋中的哺乳動物。弓形蟲感染宿主后可引起視網(wǎng)膜病變、腦膜腦炎等病變,還可引起孕婦的流產(chǎn)、死產(chǎn)、畸形或先天性感染等。在納蟲空泡的形成和修飾過程中發(fā)揮重要作用的棒狀體蛋白,可在某種程度上影響宿主細(xì)胞內(nèi)弓形蟲的增殖和毒力。本研究采用分子生物學(xué)方法構(gòu)建了真核表達(dá)載體pVAX1-ROP18-ROP12,并將其轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞),經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR鑒定該重組質(zhì)粒能在HeLa細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá)后,免疫BALB/c小鼠,通過檢測免疫相關(guān)指標(biāo)來評估該重組質(zhì)粒對小鼠的免疫保護(hù)性。首先,根據(jù)已發(fā)表的弓形蟲TgROP18和TgROP12基因序列分別設(shè)計引物。采用Trizol法提取弓形蟲速殖子總RNA,并通過逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)獲得TgROP18基因、TgROP12基因。經(jīng)酶切、連接等步驟構(gòu)建成pVAX1-ROP18-ROP12真核表達(dá)載體,并通過PCR鑒定、酶切鑒定和序列分析進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示,Tg ROP18、TgROP12基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別為1 662bp和711bp,pVAX1-ROP18-ROP12質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為2 373bp,酶切鑒定結(jié)果正確。測序結(jié)果與已報道的TgROP18基因序列的一致性為100%,與已報道的TgROP12基因序列的一致性為99%。表明已成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-ROP18-ROP12。然后,將重組質(zhì)粒pVAX1-ROP18-ROP12轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48小時后提取各組HeLa細(xì)胞的總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測重組質(zhì)粒pVAX1-ROP18-ROP12在HeLa細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況,并大量制備重組質(zhì)粒pVAX1-ROP18-ROP12。最后,將重組質(zhì)粒pVAX1-ROP18-ROP12經(jīng)肌肉注射免疫小鼠。同時設(shè)立單基因質(zhì)粒組(pVAX1-ROP18質(zhì)粒組和pVAX1-ROP12質(zhì)粒組)、空質(zhì)粒pVAX1組、PBS組和空白組。各組小鼠均間隔兩周免疫一次,前后共免疫四次,末次免疫劑量加倍。每次免疫前與末次免疫后兩周采集各組小鼠的血液,分離血清后測定抗體水平;在末次免疫后兩周,每組無菌取6只小鼠脾臟并制成脾細(xì)胞懸液,接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)不同時間后取脾細(xì)胞培養(yǎng)物上清測定細(xì)胞因子水平;同時,對剩余小鼠進(jìn)行弓形蟲速殖子攻擊感染,觀察并記錄各組小鼠的存活時間。結(jié)果顯示,實(shí)驗組小鼠的抗體水平和細(xì)胞因子水平隨著免疫次數(shù)的增加而逐漸升高。末次免疫后,實(shí)驗組的抗體水平和細(xì)胞因子水平明顯升高,與其他組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。弓形蟲速殖子攻擊感染后,與其它組比較,實(shí)驗組小鼠存活時間明顯延長(P0.05),表明復(fù)合基因質(zhì)粒pVAX1-ROP18-ROP12能誘發(fā)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答,這將為ROP18-ROP12復(fù)合基因疫苗的深入研究提供資料。
【關(guān)鍵詞】：剛地弓形蟲 ROP18-ROP12復(fù)合基因 基因疫苗 免疫應(yīng)答
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 縮略詞表10-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-28
• 結(jié)果28-32
• 附圖32-42
• 附表42-44
• 討論44-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-55
• 綜述 剛地弓形蟲棒狀體蛋白及其核酸疫苗的研究進(jìn)展55-71
• 參考文獻(xiàn)63-71
• 致謝71-72
• 個人簡歷72

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 郭玲玲;王春苗;張進(jìn)順;張曉磊;賈曉暉;姜文靜;劉楠;;剛地弓形蟲ROP12蛋白的生物信息學(xué)分析[J];中國病原生物學(xué)雜志;2015年06期

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本文編號：1025908