本文關鍵詞：光化學法聯(lián)合凝血酶注射構建大鼠顱內靜脈竇血栓形成模型的實驗研究

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【摘要】：研究背景：顱內靜脈竇血栓形成(Cerebral venous sinus thrombosis, CVST)是一組由多種病因所導致罕見的腦靜脈系統(tǒng)疾病,其臨床癥狀復雜多變,且嚴重危害到人類的生命。由于皮層靜脈及靜脈竇主干形成血栓,能夠繼發(fā)性引起腦水腫、缺血性腦損傷、腦出血、顱內高壓、昏迷、神經功能缺陷甚至死亡。成年人每年發(fā)病率為4-5/10萬人,兒童每年的發(fā)病率為7/100萬人。并且,CVST的發(fā)病率在逐年增高,約占腦血管意外疾病1%。其發(fā)病原因有口服避孕藥、妊娠、產褥期等,約75%的患者為成年女性。近年來,隨著診斷技能、神經影像技術、治療技術的發(fā)展,超過80%的病人都得到了良好的預后。近年來,CVST動物模型被用于血腦屏障破壞、腦水腫形成等病理生理變化研究及藥物治療效果評估。然而,目前所建立的CVST動物模型的手段及病理生理研究結果有較大的差異性,一個穩(wěn)定的CVST動物模型需具備以下特性：1、能夠模擬人類CVST的病理生理變化特點；2、CVST的階段性變化與人類保持一致；3、提供一個可供評估治療效果的測試平臺。然而,迄今為止仍然缺少能夠完全滿足上述特點的動物模型方案。目前國內的研究通過以下幾種方式來構建CVST動物模型：1、上矢狀竇單純結扎或阻塞法；2、結扎上矢狀竇后注射促凝物質；3、單純凝血酶注射4、血管介入球囊阻塞下注射凝血酶；5、氯化鐵(FeCl3)溶液濕敷。已有研究證實,血栓所累及的皮層靜脈及橋靜脈越多,其腦損傷程度越大。皮層靜脈及橋靜脈堵塞后,血流無法通過側支循環(huán)進行代償,可引起靜脈缺血性腦梗死。然而,上述動物模型構建方法都無法在避免永久結扎靜脈竇的情況下,使得靜脈竇及皮層靜脈同時形成血栓。光敏劑在腦血管循環(huán)時,在激發(fā)光照射下,可產生光化學反應,從而釋放氧自由基,氧自由基是一種有害的代謝物質,能夠造成生物膜系統(tǒng)損傷及細胞內氧化磷酸化障礙。一方面,氧自由基可與血管內皮細胞膜上的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化反應。脂質過氧化物增加可破壞PGI2與TXB2的平衡,促進血小板聚集粘附,激活凝血過程。另一方面,自由基也可損傷內皮細胞,使血管壁的內皮細胞的細胞膜脫落,暴露出內皮下層的基底膜,內皮下層富含氨基葡聚糖與膠原物質,能夠促進血小板的粘附與聚集。內皮細胞受損后白細胞向血管內皮細胞粘附,加重損傷,形成惡性循環(huán),最終在血管中形成血栓。光化學法的血栓形成過程與人類腦血栓形成發(fā)病機制、血栓形成過程、損害程度較為相近,加之光照或光敏劑對血管本身不存在機械性損害,與臨床上的血栓性疾病的病理、生理上的發(fā)病機制極為相似。光化學法形成的血栓富含紅細胞、血小板及纖維蛋白,類似于臨床上靜脈紅色血栓的病理結構。該方法可造成血小板聚集及血管內皮細胞損傷,為抗血小板聚集藥和抗血栓藥物及預防血栓藥物的研究提供可能性,因而可廣泛用于CVST等腦血管病的基礎與臨床研究。本課題旨在現(xiàn)有CVST動物模型的研究基礎上,在通過光化學法聯(lián)合凝血酶注射的方式構建一個可用于基礎、臨床試驗研究的大鼠上矢狀竇.皮層靜脈血栓模型,從而提供一個有利于深入CVST疾病研究及治療效果評估的平臺。顱內靜脈竇血栓形成是一種罕見的、多病因的靜脈缺血性腦卒中,發(fā)病率僅占所有中風的0.5%,然而血栓形成于靜脈的不同位置、皮層靜脈及橋靜脈的受累與否使得臨床癥狀出現(xiàn)多樣性,缺乏特征性,早期的影像學特征不明顯又給診斷添加了不少難度,容易漏診甚至誤診。近年來,隨著診斷技術及治療手段的發(fā)展,CVST的診斷率提高,大多數(shù)患者能夠得到早期治療,預后良好,死亡率大大下降。然而CVST的發(fā)病機理及生理病理學研究尚未透徹,有待進一步深入探索。CVST的病理生理改變是個復雜的過程,其動態(tài)改變在判斷疾病預后發(fā)展過程中顯得尤為重要,目前國內外少有相關報道。在本研究中,我們通過光化學法聯(lián)合凝血酶注射形成穩(wěn)定、可重復的CVST動物模型并通過觀察血腦屏障通透性、腦水腫、腦損傷和神經功能狀態(tài)在較長的時間內的動態(tài)改變,探索CVST不同發(fā)展階段的病理生理學特點,為于臨床治療提供理論基礎并對疾病的發(fā)展作出預后判斷。第一部分光化學法聯(lián)合凝血酶注射構建大鼠CVST模型研究目的：構建一種新型CVST動物模型,檢測血栓形成的位置及范圍,為評估模型穩(wěn)定性、可重復性及探索大鼠CVST模型的病理生理動態(tài)改變奠定基礎。研究方法：將Wistar成年大鼠麻醉后,放置在保暖毯,維持體溫約37攝氏度,進行靜脈置管。置管完畢后將大鼠擺置呈俯臥位,腦立體定向固定。頭部正中切皮2cm,雙氧水腐蝕筋膜及肌肉暴露骨面,于前囟及人字縫之間設計骨窗,在外科顯微鏡觀察下,邊用高速顱骨鉆鉆開骨窗,邊用生理鹽水冷卻。擴大骨窗,保留硬腦膜,暴露上矢狀竇、皮層靜脈及部分腦皮層。開啟全固態(tài)半導體激光器,固定光源位置,并確定激光照射位置,將孟加拉玫瑰紅溶液以1mg/kg/min的速度經尾靜脈緩慢注射,即用波長532nm、功率密度15 mw/mm2、直徑1mm光斑的激光束照射距后囟0.5mm的上矢狀竇尾端處及距前囟0.5mm的上矢狀竇頭端處,各持續(xù)10min,觀察到照射處血管形成棕黑色血凝塊。隨后穿刺上矢狀竇頭端,緩慢注射凝血酶,持續(xù)10min后拔出穿刺針。使用血管熒光造影法檢測血栓形成范圍。研究結果：凝血酶注射15min后,在模型組中,通過外科顯微鏡可觀察到上矢狀竇及皮層靜脈血液凝結成暗紅色血凝塊。熒光體視顯微鏡下觀察到無造影劑殘留的上矢狀竇、橋靜脈及皮層靜脈呈黑色顯影,而對照組無明顯的血栓形成及黑色顯影。研究結論：通過光化學法產生的自由基可損傷內皮細胞,使血管壁的內皮細胞的細胞膜脫落,暴露出內皮下層的基底膜,內皮下層富含氨基葡聚糖與膠原物質,能夠促進血小板的粘附與聚集,激活凝血過程,誘導上矢狀竇頭尾兩端血栓形成。通過凝血酶注射,使凝血酶擴散至橋靜脈及皮層靜脈中,使血管中的血液凝結。通過外科顯微鏡鏡下觀察及血管熒光造影法證實了血栓在上矢狀竇、橋靜脈及皮層靜脈中形成,從而建立起大鼠上矢狀竇-皮層靜脈模型。第二部分探索大鼠CVST模型的病理生理動態(tài)改變研究目的：建立大鼠上矢狀竇-皮層靜脈模型,檢測其血腦屏障完整性、腦含水量、神經功能、腦梗死體積、梗死部位的血管及神經膠質細胞的動態(tài)變化情況。研究方法：將143只Wistar成年大鼠隨機分為模型組,假手術組,控制對照組,在不同分組中根據研究的時間點分為第1天、第2天、第7天3個亞組。根據不同分組進行處理,在不同的時間點對大鼠麻醉,并灌注固定,取大鼠上矢狀竇、硬腦膜及大腦組織,應用依文思藍熒光染色在熒光顯微鏡下觀察大腦皮層的血腦屏障完整性改變情況；通過干濕重法測定腦的含水量,了解腦水腫程度變化；轉桿實驗檢測大鼠的神經功能改變；TTC染色、HE染色及MAP-2免疫組化測定腦梗死的體積及范圍；免疫組化法檢測梗死部位的血管生成情況及神經膠質細胞的數(shù)量改變。研究結果：實驗結果顯示,與假手術組及控制對照組相對比,實驗組大鼠大腦皮層處血腦屏障及神經功能在術后第1天時受損,且在第2天時損傷程度加重,同時伴隨著腦水腫,然而在第7天時,血腦屏障完整性、腦含水量及神經功能逐漸恢復正常；TTC染色、HE染色及MAP-2免疫組化顯示大鼠在術后第1天出現(xiàn)腦梗死,在第2天時腦梗死體積達到最大,同時可見腦缺血壞死、出血、腦水腫等病理改變,隨后在第7天時梗死體積逐漸縮��；免疫組化結果顯示微血管數(shù)量在術后第1天、第2天保持恒定,而星形膠質細胞的數(shù)量在第1天、第2天時顯著減少,但在第7天時,微血管及星形膠質細胞數(shù)量明顯多于正常組及模型組。研究結論：證實了通過光化學法聯(lián)合凝血酶注射構建的大鼠CVST模型能夠模擬人體CVST的病理生理改變,通過探索大鼠CVST模型不同疾病發(fā)展階段的病理生理改變,為臨床治療提供了干預契機,從而減少致殘率及死亡。
【關鍵詞】：顱內靜脈竇血栓形成 動物模型 血腦屏障 腦水腫 光化學反應
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R743;R-332
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-26
• 參考文獻23-26
• 第一部分 光化學法聯(lián)合凝血酶注射構建大鼠CVST模型26-39
• 一、引言26-27
• 二、實驗材料和方法27-32
• 三、結果32-33
• 四、討論33-36
• 小結36
• 參考文獻36-39
• 第二部分 探索大鼠CVST模型的病理生理動態(tài)改變39-64
• 一、引言39-40
• 二、實驗材料和方法40-50
• 三、結果50-56
• 四、討論56-60
• 小結60
• 參考文獻60-64
• 全文總結64-66
• 中英文縮略詞66-68
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文68-69
• 致謝69-71

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