本文關(guān)鍵詞：豬胚胎來(lái)源干細(xì)胞建系方法的初步研究

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【摘要】：哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESC)和滋養(yǎng)層干細(xì)胞(trophoblast stem cells, TSC)均屬于胚胎來(lái)源的干細(xì)胞,由早期胚胎或內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass, ICM)培養(yǎng)而來(lái)。胚胎干細(xì)胞已經(jīng)在小鼠、人、猴子和大鼠上成功建系,滋養(yǎng)層干細(xì)胞也已經(jīng)在小鼠、人、兔子和猴上成功建立。但無(wú)論是胚胎干細(xì)胞還是滋養(yǎng)層干細(xì)胞,在有蹄類(lèi)大動(dòng)物上均未取得成功。由于豬在體型和相關(guān)生理功能方面都與人類(lèi)十分接近,所以豬胚胎干細(xì)胞和滋養(yǎng)層干細(xì)胞是研究人類(lèi)相關(guān)基因疾病以及異種移植的最佳模型。本研究初步摸索豬滋養(yǎng)層干細(xì)胞的建系方法；同時(shí)構(gòu)建高表達(dá)白血病抑制因子(leukemia inhibitor factors,LIF)的飼養(yǎng)層細(xì)胞,并構(gòu)建豬源轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)載體,以期提高豬胚胎干細(xì)胞的質(zhì)量及建系效率。目的通過(guò)接種體外受精囊胚,建立豬滋養(yǎng)層干細(xì)胞系；建立高效表達(dá)豬LIF的STO細(xì)胞系,優(yōu)化豬胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)條件；構(gòu)建豬源轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)載體,輔助豬胚胎干細(xì)胞建系。方法1.通過(guò)接種體外受精囊胚,建立豬滋養(yǎng)層干細(xì)胞系：通過(guò)體外受精和發(fā)育培養(yǎng)獲得第6天囊胚,去除透明帶后將全胚接種于STO飼養(yǎng)層上,用FGF系統(tǒng)干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)滋養(yǎng)層干細(xì)胞,并利用機(jī)械切割的方法進(jìn)行傳代,通過(guò)形態(tài)學(xué)和堿性磷酸酶染色方法鑒定其干細(xì)胞特性。2.通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的技術(shù),將已構(gòu)建的豬LIF基因真核表達(dá)載體pCAG-pLIF轉(zhuǎn)染至小鼠STO細(xì)胞中,通過(guò)藥物篩選獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)豬LIF的轉(zhuǎn)基因STO細(xì)胞(STO-pLIF細(xì)胞)。通過(guò)QPCR、Western blot等方法檢測(cè)STO-pLIF細(xì)胞中豬LIF的表達(dá)量。選擇高效表達(dá)豬LIF的STO-pLIF細(xì)胞作為飼養(yǎng)層,培養(yǎng)大鼠誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(induced pluripotency stem cells, iPS)。通過(guò)生長(zhǎng)曲線(xiàn)檢測(cè)、堿性磷酸酶染色、干細(xì)胞多能因子的RT-PCR檢測(cè)和免疫熒光染色等方法,檢驗(yàn)STO-pLIF細(xì)胞飼養(yǎng)層在大鼠iPS細(xì)胞培養(yǎng)方面的功能。3.以豬胚胎成纖維細(xì)胞(pig embryonic fibroblast, PEF)的cDNA為模板,合成或擴(kuò)增豬源OCT4、TBX3、REX1、LIN28、DPPA5五個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,利用PCR方法,將REX1、LIN28、DPPA5以E2A和T2A序列連接成3因子片段并通過(guò)測(cè)序檢測(cè)其準(zhǔn)確性,將商業(yè)構(gòu)建的OCT4和TBX3以及自行構(gòu)建的三因子片段分別經(jīng)過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶酶切后連接到誘導(dǎo)表達(dá)載體pTRE3G-ZsGreenI中,獲得三個(gè)重組表達(dá)載體。為了驗(yàn)證所構(gòu)建質(zhì)粒功能,將豬源OCT4重組表達(dá)載體和pEF1a-Tet3G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入PEF細(xì)胞中,并在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)添加強(qiáng)力霉素(DOX)誘導(dǎo)外源轉(zhuǎn)錄因子表達(dá),通過(guò)QPCR檢測(cè)載體中豬源OCT4的表達(dá)情況。結(jié)果1.所建立的滋養(yǎng)層干細(xì)胞系最高傳代至第9代,逐漸出現(xiàn)較多油滴,無(wú)法繼續(xù)傳代；由于傳代受限,無(wú)法有效擴(kuò)增細(xì)胞系,后續(xù)的核型鑒定和堿性磷酸酶染色結(jié)果均不理想。2.獲得豬LIF轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性STO細(xì)胞系,STO-pLIF細(xì)胞中LIF基因和蛋白的表達(dá)量均有上調(diào)；該細(xì)胞系作為飼養(yǎng)層所培養(yǎng)的大鼠iPS細(xì)胞在形態(tài)、多能性因子表達(dá)方面更接近于含LIF的傳統(tǒng)培養(yǎng)液培養(yǎng)的大鼠iPS細(xì)胞,顯著優(yōu)于無(wú)外源LIF添加的培養(yǎng)液所培養(yǎng)的大鼠iPS細(xì)胞。3.成功構(gòu)建豬源轉(zhuǎn)錄因子重組表達(dá)載體,在豬源OCT4重組表達(dá)載體與pEF1a-Tet3G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)PEF細(xì)胞并經(jīng)DOX誘導(dǎo)表達(dá)后,利用QPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其有效提高了PEF細(xì)胞中OCT4轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量。結(jié)論1.盡管接種體外受精囊胚能夠形成滋養(yǎng)層干細(xì)胞,但是由于培養(yǎng)條件、傳代方法等問(wèn)題仍然無(wú)法穩(wěn)定傳代,還需進(jìn)一步優(yōu)化方法。2.成功獲得了穩(wěn)定表達(dá)豬LIF基因的STO-pLIF細(xì)胞,并證明該細(xì)胞作為飼養(yǎng)層在大鼠iPS細(xì)胞培養(yǎng)中具有一定優(yōu)勢(shì)。3.成功構(gòu)建豬源轉(zhuǎn)錄因子的重組表達(dá)載體,將進(jìn)一步利用其轉(zhuǎn)染的PEF細(xì)胞誘導(dǎo)形成iPS細(xì)胞或輔助建立豬胚胎干細(xì)胞系。
【關(guān)鍵詞】：豬滋養(yǎng)層干細(xì)胞 白血病抑制因子 STO細(xì)胞 重組誘導(dǎo)表達(dá)載體 豬源轉(zhuǎn)錄因子
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R321
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 第一部分 建立豬滋養(yǎng)層干細(xì)胞系12-34
• 前言12-13
• 材料與方法13-25
• 結(jié)果25-30
• 討論30-32
• 參考文獻(xiàn)32-34
• 第二部分 建立穩(wěn)定表達(dá)豬LIF蛋白的小鼠STO細(xì)胞系34-59
• 前言34-36
• 材料與方法36-48
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果48-54
• 討論54-57
• 參考文獻(xiàn)57-59
• 第三部分 構(gòu)建豬源轉(zhuǎn)錄因子重組表達(dá)載體59-79
• 前言59-61
• 材料與方法61-69
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果69-76
• 討論76-77
• 參考文獻(xiàn)77-79
• 綜述部分79-85
• 參考文獻(xiàn)83-85
• 全文主要縮略語(yǔ)85-87
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況及科研工作情況87-88
• 致謝88-89

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 楊寧;趙麗華;張曼玲;金永;侯道榮;吳兆強(qiáng);陳袁;李榮鳳;;建立高效表達(dá)豬LIF的豬胚胎成纖維細(xì)胞系[J];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2015年07期

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本文編號(hào)：953761