本文關鍵詞：大鼠應激性心肌病初發(fā)及復發(fā)模型的制備研究

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【摘要】：[研究背景]應激性心肌病(Stress Cardiomyopathy,SCM)是一種逐漸被人們認識的急性心臟綜合征,其臨床特征包括可逆性左心室功能障礙和局部室壁運動異常及類似急性心肌梗死的心電圖ST-T改變和輕度心肌酶升高,但大部分無冠狀動脈的阻塞性病變,多見于老年女性,且發(fā)病前多有情感和生理上的誘因。該病于1990年首次被日本學者提出,因其急性期左室收縮末期形態(tài)像日本漁民捕捉章魚的魚簍,又稱TakoTsubo(章魚簍)心肌病(Takotsubo cardiomyopathy,TTC),也曾命名為短暫的左心室心尖部氣球樣變(transient left ventricular apicalballooning).心碎綜合征(broken heart syndrome).壺腹心肌病(ampullacardiomyopathy)等。由于SCM表現酷似急性冠脈綜合征,在疑似急性冠脈綜合癥的患者中占比2%,因此是急診胸痛診斷中的重要鑒別診斷； SCM病人心功能障礙多于數天至數周完全恢復,總體預后良好,96%的病人幾近康復,但在急性期仍然是一種致命性疾病,Sharkey等報道約5%的病人出現過心臟驟停。急性期患者會出現惡性心律失常、心源性休克、心室壁破裂,使其住院死亡率達0%-8%。遠期死亡率0%-17%；遠期復發(fā)率0%-11.4%；首次發(fā)作后4年里最常見的癥狀是胸部疼痛(30%)。SCM作為一種新認識的綜合征,其病例報告的數量迅速增加,但對其發(fā)病機制、規(guī)范治療尚缺充分的認識和證據。故進一步研究、認識該疾病有重要的臨床意義及社會價值。SCM特征性形態(tài)學改變?yōu)樾募獠渴冶谶\動消失呈氣球樣膨脹,心基底部運動增強,此為典型SCM,約占85%,如室壁運動異常不在心尖部,而在其他部位的則為非典型SCM,非典型SCM中大部分表現為心尖部運動增強,而心基底部心肌運動消失,即“倒Takotsubo心肌病”(inverted TTC),還有小部分累及左心中部或其他節(jié)段。SCM復發(fā)時室壁運動異常的部位(類型)不一定與首次發(fā)病時一致。SCM多樣化的臨床表現提示該病涉及多因素、多方面的病理生理機制,針對短暫性可逆性左心功能障礙,目前提出幾種假說：(1)交感神經過度興奮和兒茶酚胺毒性介導的心肌頓抑；(2)雌激素水平降低,削弱了其心臟保護作用；(3)心肌脂肪酸代謝異常,脂肪酸的μ氧化被抑制,從而對心肌供能的不足影響心肌的收縮功能；(4)冠狀動脈痙攣；(5)冠狀動脈微循環(huán)障：(6)急性左室流出道梗阻。其中兒茶酚胺介導的神經源性心肌毒性被認為是最可能的機制。在身體或情緒壓力應激狀態(tài)下,產生內源性兒茶酚胺;Wittstein等研究顯示SCM患者的血漿腎上腺素、去甲腎上腺素水平比正常人高7-34倍,較急性心肌梗死患者(killip III)高2-3倍；另外,注射外源性兒茶酚胺如腎上腺素和疾病條件下如分泌兒茶酚胺的嗜鉻細胞瘤均可誘導類似室壁運動異常,支持著兒茶酚胺毒性假說。哺乳動物左心室p受體和交感神經由心尖到心基底存在梯度性分布,心尖部p受體的密度最高而交感神經分布最少,故推測心尖部對兒茶酚胺較敏感使該部分容易受累,且循環(huán)中高水平的腎上腺素發(fā)揮著最為關鍵的作用,高水平的腎上腺素可通過β2受體耦聯(lián)抑制性G蛋白(inhibitory G protein, Gi)信號通路發(fā)揮負性肌力作用,心尖部p2受體密度較基底部高易出現頓抑,表現為典型SCM。在實驗動物研究上,高劑量腎上腺素(p1、p2和a激動劑)、異丙腎上腺素(β1、p2激動劑)可成功誘發(fā)典型SCM動物模型,支持β2受體心尖部的高密度分布與典型SCM存在一定關系。研究顯示p1只能耦聯(lián)興奮性G蛋白(stimulatory G protein, Gs)產生正性肌力作用,而β2受體可耦合Gs和Gi,因此,去甲腎上腺素不能介導Gi通路產生負性肌力作用。Paur等通過給大鼠靜脈注射高劑量的腎上腺素成功誘發(fā)典型SCM,而同樣高劑量的去甲腎上腺素(β1、α激動劑)卻不能成功造模。但Redfors等實驗研究表明采用去甲腎上腺素腹腔注射可誘發(fā)出非典型SCM。目前研究多用異丙腎上腺素、腎上腺素誘發(fā)模型建立,因異丙腎上腺素與腎上腺素生物學效應相似,以異丙腎上腺素造模的研究占多數,然而異丙腎上素是人工合成兒茶酚胺衍生物,并非人體內源性兒茶酚胺,去甲腎上腺雖與腎上腺素同為內源性激素,但在去甲腎上腺素造模上存在一定的爭議,甚少采用去甲腎上腺素造模；且國內外研究中對SCM復發(fā)造模的探索尚屬空白；對SCM左心區(qū)域性節(jié)段改變是否決定于左心腎上腺素受體的梯度分布尚無明確答案,鑒于此,本課題采用去甲腎上腺素探索制備大鼠SCM模型及復發(fā)模型,同時探索異丙腎上腺素復發(fā)造模的建立與之作比較,并以此初步研究SCM的表現類型與左心α1、β1、β2受體分布的關系,以期為今后進一步研究SCM發(fā)病機制,明確發(fā)病類型,防治該病奠定一定的實驗基礎。第一部分去甲腎上腺素制備大鼠應激性心肌病模型的劑量研究[目的]探索應用去甲腎上腺素(NA)制備大鼠應激性心肌病(SCM)模型的最適劑量,為進一步開展實驗研究奠定基礎。[方法]30只雄性SD大鼠(300-350 g)按隨機數字表法隨機分成5個組,分別接受NA 1,2,3,4,5 mg/KG腹腔注射用于探索最適劑量。給藥90 min后檢測大鼠心率、肛溫,并采用超聲心動圖觀察室壁運動,以出現左室功能障礙,心尖節(jié)段(典型)或非心尖節(jié)段(非典型)室壁運動失活判定成功造模。1周后復查超聲心動圖,觀察室壁運動恢復情況。[結果](1)NA劑量≥2mg/KG可誘發(fā)出節(jié)段性室壁運動異常的SCM模型且1周內可自行恢復正常。其中4 mg/Kg組成功率最高66.67%(4/6只),共有4只大鼠造模成功(典型SCM 1只,非典型SCM 3只)。(2)隨著NA劑量的增加,2h死亡率、大鼠肛溫及心率隨之增加,5 mg/Kg組2h內半數致死。[結論](1)應用NA腹腔注射可成功制備典型與非典型SCM模型,4 mg/Kg為造模的最適劑量。(2)該制備方法簡單,重復性好,支持兒茶酚胺毒性效應為SCM的發(fā)病機制的假說。第二部分應激性心肌病初發(fā)、復發(fā)模型制備及發(fā)病機制初探[目的]探討應用去甲腎上腺素(NA)及異丙腎上腺素(ISO)制備SCM復發(fā)模型的可能性,比較兩者造模類型的特點,為今后研究該病提供良好的動物模型；同時初步探討左室心肌腎上腺素α1、β1、β2受體分布與典型及非典型SCM發(fā)生的關系。[方法]60只雄性SD大鼠(300-350 g)分成兩部分用于本研究。(1)應用去甲腎上腺素制備初發(fā)及復發(fā)SCM模型的研究。根據第一部分研究結果確定去甲腎上腺素4mg/KG為最適劑量,45只接受4mg/KG去甲腎上腺素腹腔注射進行初發(fā)造模及1周后復發(fā)造模,給藥90min后采用超聲心動圖分別對心尖段、心中間段、心基底段行M超檢測比較各節(jié)段的運動波幅,測量短軸縮短率(FS%),判斷造模結果,成功初發(fā)造模的大鼠,取典型、非典型各5只處死取心肌組織行病理檢查(該組標記為初發(fā)造模組),余下的正常喂養(yǎng),于第7天復查超聲,將室壁運動恢復正常的大鼠按類型取出總數的2/3于第8天進行復發(fā)造模,成功復發(fā)造模的大鼠處死取心肌組織行病理檢查(即為：復發(fā)造模組)；其余1/3為作為恢復組,予生理鹽水腹腔注射用作復發(fā)對照后處死取心肌組織行病理檢查。對左心室基底段、心尖段心肌組織行HE染色及腎上腺素能受體α1、β1、β2免疫組化染色,觀察病理形態(tài)改變及受體表達情況,評價動物模型,比較急性期與恢復期病理變化,比較運動減弱節(jié)段與運動增強節(jié)段的心肌損傷程度；采用Image-ProPlus圖像軟件分析半定量的方法比較各實驗組間心基底段與心尖段αl受體、β1受體、β2受體表達的比值,研究NA大鼠SCM的表現類型與左心室α1、β1、β2受體解剖分布的關系。5只予等量的生理鹽水腹腔注射作為正常對照組,完成超聲檢測后處死取心肌組織行病理檢查。(2)應用異丙腎上腺素制備SCM模型的研究。10只接受50 mg/KG異丙腎上腺素腹腔注射進行造模,成功造模后正常喂養(yǎng)1周復查超聲心動圖,于第8天對室壁運動恢復正常的大鼠予復發(fā)造模。[結果](1)NA初發(fā)造模大鼠中,造模成功26只,總成功率為57.8%,非典型SCM 21只(20只為倒章魚簍型的非典型SCM；1只表現為中間節(jié)段型SCM),占81%,典型5只,占19%。成功造模大鼠7d內異常運動的室壁可自行恢復正常(各節(jié)段FS%與正常組相比P0.05),其中10只非典型SCM大鼠復發(fā)模型誘導成功率為30.0%(3/10),且均成功轉變?yōu)榈湫蚐CM,轉型率為100%(3/3);(2)HE染色見成功造模大鼠心肌纖維均有不同程度的心肌纖維變性、水腫、收縮帶壞死,未見明顯的心肌細胞凋亡壞死。初發(fā)造模組中心肌運動減弱段(典型SCM的心尖+非典型SCM心基底段)比心肌運動增強段(典型SCM的心肌基底段+非典型SCM心尖段)收縮帶壞死嚴重(Z=-2.145,P=0.0430.05);恢復組見心肌纖維變性、水腫基本恢復,可見少量炎癥細胞浸潤及零星收縮帶壞死。(3)正常對照組α1、β1、β2受體心基底段與心尖段的比值分別為0.87,1.12,0.85(中位數),與其他各組的比值比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(4)10只接受50 mg/kg ISO造模的大鼠中成功初發(fā)造模6只,成功率60%,均為典型SCM,一周后復發(fā)造模見6只大鼠中有5只成功復發(fā),復發(fā)成功率為83%(5/6),類型與初發(fā)時類型一致為典型SCM,類型轉變率為0%。[結論](1)去甲腎上腺素及異丙腎上腺素均可用于初發(fā)或復發(fā)SCM模型的制備。(2)初發(fā)造模時,NA造模以非典型SCM為主,ISO造模以典型SCM為主；復發(fā)造模時,室壁運動異常的部位(類型)不一定與首次發(fā)病時一致,NA復發(fā)造模SCM類型可改變,ISO復發(fā)造模類型未見改變。(3)運動減弱節(jié)段心肌損傷程度較嚴重,但1周后運動功能可恢復至正常,而心肌組織仍可見零星收縮帶壞死。(4)大鼠左心腎上腺素受體存在解剖學梯度分布差異,β2受體、αl受體的優(yōu)勢區(qū)域在心尖部(密度高),β1的優(yōu)勢區(qū)域在心基底部(密度高),這種梯度分布差異不是直接影響SCM發(fā)病類型的決定因素,具體機制尚需進步研究探明。
【關鍵詞】：應激性心肌病 應激性心肌病復發(fā) 去甲腎上腺素 異丙腎上腺素 動物模型 腎上腺素受體
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R542.2;R-332
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-21
• 第一部分 去甲腎上腺素制備大鼠應激性心肌病模型的劑量研究21-28
• 1.1 前言21-22
• 1.2 材料及方法22-23
• 1.3 結果23-26
• 1.4 討論26-28
• 第二部分 應激性心肌病初發(fā)、復發(fā)模型制備及發(fā)病機制初探28-52
• 2.1 前言28-29
• 2.2 材料及方法29-33
• 2.3 結果33-41
• 2.4 討論41-52
• 全文總結52-53
• 創(chuàng)新性、局限性與展望53-55
• 中英文縮略詞表55-56
• 參考文獻56-65
• 論文發(fā)表情況65-66
• 致謝66-68

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