本文關(guān)鍵詞：慢病毒介導(dǎo)的綠色熒光蛋白基因在日本血吸蟲體內(nèi)的表達和檢測

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【摘要】：目的驗證外源綠色熒光蛋白基因在日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)體內(nèi)能否成功表達并產(chǎn)生綠色熒光。方法采用熒光顯微鏡觀察日本血吸蟲不同蟲期蟲體的背景熒光情況。利用含有由巨細胞病毒(CMV)啟動子驅(qū)動的綠色熒光蛋白zs Green基因的慢病毒載體感染體外培養(yǎng)的14 d童蟲,未感染對照組采用不含慢病毒的RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)培養(yǎng)。感染后48 h,提取童蟲基因組DNA和總RNA,合成c DNA,PCR檢測zs Green基因是否整合入基因組以及綠色熒光蛋白m RNA的轉(zhuǎn)錄表達情況。在感染后24和48 h,以及換為不含慢病毒的RPMI 1640培養(yǎng)液后的不同時間點,使用熒光顯微鏡觀察被感染童蟲發(fā)出的綠色熒光,并判斷其是否為綠色熒光蛋白基因在蟲體內(nèi)表達而產(chǎn)生的綠色熒光信號。結(jié)果熒光顯微鏡觀察可見,日本血吸蟲童蟲無明顯自發(fā)熒光現(xiàn)象,成蟲可自發(fā)明顯熒光。感染組童蟲基因組DNA和總c DNA PCR檢測結(jié)果顯示,均擴增出大小為173 bp的陽性條帶,與zs Green基因片段一致,且測序結(jié)果正確。熒光顯微鏡觀察可見,而感染組童蟲在感染后24 h,腸道內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光亮點,但疑似食物殘渣。感染后48 h,童蟲腸道發(fā)出均勻的綠色熒光,其亮度高于慢病毒培養(yǎng)液的背景熒光亮度。更換為不含慢病毒的RPMI 1640培養(yǎng)液3 d后,童蟲腸道內(nèi)綠色熒光變?nèi)?一周后綠色熒光消失。重新更換為含慢病毒的RPMI 1640培養(yǎng)液感染童蟲,2 d后在腸道內(nèi)再次發(fā)現(xiàn)均勻綠色熒光。未感染對照組童蟲未出現(xiàn)綠色熒光。結(jié)論外源綠色熒光蛋白可在日本血吸蟲體內(nèi)表達,但熒光顯微鏡下觀察到的綠色熒光信號還有待進一步確認。
【作者單位】： 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物與微生物工程系;中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所 世界衛(wèi)生組織熱帶病合作中心 科技部國家級熱帶病國際聯(lián)合中心 衛(wèi)生部寄生蟲病原與媒介生物學(xué)重點實驗室;
【關(guān)鍵詞】： 日本血吸蟲 綠色熒光蛋白 慢病毒載體
【基金】：國家自然科學(xué)基金(No.81271867) 國際科技合作與交流專項支持(No.2014DFA31130)~~
【分類號】：R383.24
【正文快照】： 近年來,日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)基因組和轉(zhuǎn)錄組全面測序已完成,并獲得了大量的基因數(shù)據(jù)[1,2]。利用反向遺傳學(xué)方法對日本血吸蟲進行基因操縱,這些基因的生理功能是目前的研究熱點[3-5]。在曼氏血吸蟲(S.mansoni)中已證明,利用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染可以將外源基因?qū)胙?

【相似文獻】

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本文編號：770394