本文關(guān)鍵詞：PHB2在TH17細(xì)胞中的調(diào)控作用

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【摘要】：目的：TH17細(xì)胞不僅在細(xì)菌和真菌感染中具有重要保護(hù)作用,在自身免疫性疾病中也有重要作用。維甲酸相關(guān)孤兒核受體(Retinoid-related orphan receptor gammaT, RORγt)是TH17細(xì)胞關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄因子,決定了TH17細(xì)胞的分化并誘導(dǎo)促炎因子如IL-17等的表達(dá)。通過(guò)前期質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)PHB2與RORγt具有相互作用,而PHB2是一種結(jié)構(gòu)高度保守,分布廣泛,表達(dá)豐富的膜蛋白家族成員,且在T細(xì)胞活化過(guò)程中是上調(diào)的,形成磷酸化復(fù)合物定位于T細(xì)胞線粒體內(nèi)膜上,對(duì)維持線粒體的完整性和T細(xì)胞的活化,分化和生存具有重要意義。故本研究通過(guò)免疫共沉淀,RNA干擾等技術(shù),以期探討PHB2如何對(duì)TH17細(xì)胞分化發(fā)揮調(diào)控作用及其調(diào)控機(jī)制。方法：首先通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出PHB2完整序列,構(gòu)建到HA-pIP表達(dá)質(zhì)粒中,在人胚腎細(xì)胞HEK293T中共轉(zhuǎn)染Flag-RORγt與HA-PHB2,通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證PHB2與RORγt是否具有相互作用。構(gòu)建約600bp大小的IL-17A啟動(dòng)子報(bào)告基因,用PEI轉(zhuǎn)染法在HEK293T細(xì)胞系過(guò)表達(dá)PHB2,RORγt和報(bào)告基因,通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)探討PHB2對(duì)RORγt功能的影響。然后通過(guò)電轉(zhuǎn)法在人淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)PHB2, RORγt和報(bào)告基因,通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)探PHB2對(duì)RORγt功能的影響。設(shè)計(jì)兩對(duì)針對(duì)PHB2的特異性shRNA,構(gòu)建包裝表達(dá)shRNA的慢病毒載體,同時(shí)構(gòu)建一對(duì)過(guò)表達(dá)PHB2的慢病毒載體,兩者均通過(guò)PEI法與質(zhì)�！�8.9,VSV-G共同轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中,48小時(shí)后收上清,通過(guò)超速離心法濃縮病毒備用。隨后通過(guò)ficoll法分離出新生兒臍帶血的PBMC,用試劑盒分選出Naive CD4+T細(xì)胞,體外誘導(dǎo)出TH17細(xì)胞。將針對(duì)PHB2的shRNA和過(guò)表達(dá)PHB2的慢病毒分別直接感染Flag-RORγt-Jurkat穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞和體外誘導(dǎo)分化出的TH17細(xì)胞,在病毒感染一周左右通過(guò)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)PHB2與RORγt蛋白水平的變化,利用RT-PCR分析PHB2對(duì)TH17細(xì)胞相關(guān)炎癥因子基因水平的影響。結(jié)果：通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)和免疫印跡結(jié)果可以看到相對(duì)于對(duì)照組,共轉(zhuǎn)染Flag-RORγt和HA-PHB2組通過(guò)加入anti-HA抗體后用anti-Flag抗體免疫印跡可以看到較強(qiáng)的RORγt信號(hào)(或加入anti-Flag抗體后用anti-HA抗體免疫印跡可以看到較強(qiáng)的PHB2信號(hào))。由此結(jié)果可以得出PHB2與RORγt具有相互作用。在HEK293T細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞中的IL-17A啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)PHB2能夠有效促進(jìn)RORγt介導(dǎo)的IL-17A轉(zhuǎn)錄活性且成劑量依賴性。利用慢病毒形式過(guò)表達(dá)PHB2于Flag-RORγt-Jurkat穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞中,免疫印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)PHB2蛋白可以增強(qiáng)RORγt蛋白水平的表達(dá)。在體外成功誘導(dǎo)出TH17細(xì)胞后,并且構(gòu)建出針對(duì)PHB2的兩對(duì)shRNA都具有較好的沉默效率,在Flag-RORγt-Jurkat細(xì)胞和TH17細(xì)胞中感染針對(duì)PHB2的shRNA慢病毒后,免疫印跡結(jié)果分析得出PHB2蛋白水平明顯降低的同時(shí),RORγt蛋白水平也有所下降。RT-PCR結(jié)果分析得出消減PHB2基因表達(dá)的同時(shí)TH17細(xì)胞炎癥相關(guān)基因IL-17A下調(diào)約25%,IL-17F下調(diào)約50%。結(jié)論：本課題通過(guò)免疫共沉淀和熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)明確了PHB2與RORγt具有相互作用,且得出PHB2能夠促進(jìn)RORγt介導(dǎo)的IL-17A啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。最后通過(guò)RNA干擾技術(shù),RT-PCR和免疫印跡技術(shù)進(jìn)一步探討了PHB2通過(guò)對(duì)RORγt的蛋白水平的調(diào)控從而影響TH17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平,得出PHB2發(fā)揮對(duì)TH17細(xì)胞的正調(diào)控作用的結(jié)果。
【關(guān)鍵詞】：PHB2 RORγt RNA干擾 TH17細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中英文縮寫(xiě)對(duì)照表5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 1 前言11-17
• 2 材料17-21
• 3 實(shí)驗(yàn)方法21-36
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-45
• 5 討論45-48
• 6 結(jié)論48
• 7 參考文獻(xiàn)48-55
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷55-56
• 致謝56-57
• 綜述57-66
• 參考文獻(xiàn)62-66

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